Estudio de la conductividad eléctrica de la leche como método automático de detección de mamitis en cabras de raza murciano-granadina

Resum

La presente Tesis Doctoral, cuyo objetivo general consiste en el estudio de la conductividad eléctrica (CE) como método de detección automática de mamitis en cabras de raza Murciano-Granadina, consta de 3 Ensayos en los que se han incluido 5 experimentos diseñados con el fin de conseguir los siguientes objetivos específicos: 1.Estudiar diferentes factores de variación que afectan a la CE de la leche de cabra Murciano-Granadina a nivel de glándula (granja, número de lactación y estado de lactación de la cabra, fracción de leche ordeñada, composición de la leche, producción y estado sanitario de la glándula), además de estudiar su relación con el recuento de células somáticas (RCS): Ensayos 1 y 3 2.Desarrollar y comprobar el funcionamiento de varios prototipos de equipos de lectura automática de CE durante el ordeño: Ensayos 2 y 3. 3.Estudiar el empleo de varios algoritmos de cálculo que incluyen las lecturas diarias de CE a nivel de glándula como método de detección de mamitis. Ensayo 3 En el Ensayo 1 se realizaron 2 experimentos con el fin de estudiar el efecto de la mamitis y de los factores no infecciosos descritos en el primer objetivo específico. En el primer experimento se realizaron 3 pruebas de 7 meses de duración cada una en 3 granjas diferentes. En total se utilizaron 105 cabras (31 cabras primíparas y 74 cabras de segunda o posteriores lactaciones). Se realizaron 7 controles mensuales y en cada uno de ellos, para cada glándula, se realizó un análisis bacteriológico, se midió la conductividad eléctrica de la leche y el RCS, la composición de la leche en diversos controles a lo largo de la lactación de las Granjas 1 y 2 y la producción de las glándulas en la Granja 3. Las glándulas fueron clasificadas como libres de infección, con mamitis bacteriana (bacteriología positiva) y mamitis inespecífica (bacteriología negativa y RCS>106 cel/mL en varios controles). En el segundo experimento se utilizaron 84 cabras (28 primíparas y 56 multíparas) y se realizó un único control, en el que se hizo un análisis bacteriológico de cada glándula y se tomaron 3 fracciones de leche ordeñada: primeros 100 mL, leche máquina y últimos 100 mL. En estas fracciones de leche se determinó la CE y el RCS. En el Experimento 1 y 2 se estudió el comportamiento (sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo) en la detección de mamitis de la CE de las glándulas, y del RCS de las glándulas, estudiándose adicionalmente en el Experimento 1 el comportamiento de la diferencia de CE entre glándulas colaterales Los factores granja, número de lactación, estado de lactación, fracción de leche ordeñada, así como las interacciones tipo de mamitis x número de lactación, número de lactación x estado de lactación, tipo de mamitis x estado de lactación han tenido un efecto significativo sobre la CE, no siendo significativa la interacción de la Granja x tipo de mamitis en el experimento 1, ni la interacción del tipo de mamitis x número de lactación en el Experimento 2. El tipo de mamitis ha afectado significativamente a la lectura de la CE en las cabras primíparas, encontrándose solo diferencias entre las glándulas libres de infección intramamaria y las que padecieron mamitis inespecífica (5,2 vs 5,8 mS/cm) y no con las que sufrieron mamitis bacteriana (5,2 vs 5,3 mS/cm). En cabras multíparas no se encontraron diferencias significativas entre glándulas sin infección intramamaria y las que sufrieron diferentes tipos de mamitis. La Granja tuvo un efecto significativo sobre la CE, siendo menor en la Granja 1 con respecto a las otras 2 granjas, tanto si se consideran todas las glándulas (5,14 vs 5,78 y 5,79 mS/cm) como si se consideran solo las libres de infección intramamaria (5,01 vs 5,67 y 5,63 mS/cm). El progreso de la lactación provocó un aumento significativo de la CE en las glándulas libres de infección intramamaria mientras que no se observó un efecto significativo en las glándulas con infección bacteriana ni en las que sufrieron mamitis inespecífica. Así mismo, la CE se incrementó en las cabras multíparas pasando de 5,38 mS/m en el primer mes de lactación a 6,03 mS/cm en el séptimo mes de lactación, efecto que no ocurrió en las cabras primíparas, las cuales presentaron valores muy similares a lo largo de la lactación. La CE fue significativamente mayor en cabras multíparas que en primíparas, tanto en condiciones fisiológicas (5,7 vs 5,2 mS/cm) como con infección bacteriana (5,7 vs 5,3 mS/cm), no observándose diferencias significativas cuando sufrieron una mamitis inespecífica. La fracción de leche afectó significativamente a la lectura de la CE observándose valores significativamente menores a medida que avanzaba el ordeño (primeros 100 mL: 5,43 mS/cm; leche máquina: 5,27 mS/cm; últimos 100mL: 5,07 mS/cm). Estas diferencias se observaron en glándulas libres de infección y con mamitis. Así mismo, solo se observaron diferencias significativas entre glándulas libres de mamitis y con mamitis en la fracción de apurado (últimos 100 mL) (5,01 vs 5,14 mS/cm), no observándose un efecto significativo de la interacción del tipo de mamitis x número de lactación. Las variaciones en la composición química de la leche (especialmente en el ión cloruro), han explicado casi la totalidad de la varianza de la CE (R2=0,91), de manera que los factores que produzcan cambios en dicha composición, provocarán cambios en la CE. Aunque la relación entre la producción de leche y la CE no ha sido significativa en su conjunto (P=0,067), sí que se ha observado una relación significativa en glándulas que sufrieron mamitis (r = -0,372; P<0,001). Aunque los factores estudiados para la CE afectaron significativamente también al RCS, no se encontró una adecuada relación entre el RCS y la CE de las glándulas. El elevado número de factores que afectan a la CE en leche de cabra, distintos del estado infectivo, provocan al aplicar un umbral de CE común para todos los animales y en diferentes granjas que los resultados no sean lo satisfactorio que se espera de un método de detección de mamitis. En los distintos análisis estadísticos realizados en este Ensayo no se han encontrado unos adecuados resultados al emplear umbrales absolutos de CE o de diferencia de CE entre glándulas colaterales, ya que elegir una elevada sensibilidad implica elegir una baja especificidad y viceversa, resultando, en cualquier caso, el VPN más favorable que el VPP observado. En el Ensayo 2 se desarrollaron y evaluaron 3 prototipos de equipos para la medición automática de la CE de la leche procedente de glándulas durante el ordeño mecánico (P1: sonda inductiva; P2: sonda conductiva de acero inoxidable; P3: sonda conductiva de placas de platino). En este ensayo se realizaron 2 experimentos. En el primero se realizaron 3 pruebas a nivel de laboratorio empleando una ubre artificial con el fin de evaluar el comportamiento de los prototipos durante el ordeño con leche de cabra y estudiar el efecto de la temperatura de la leche, la naturaleza de la muestra ordeñada y el tiempo de ordeño en la lectura de la CE. En el Experimento 2 se evaluó a nivel de Granja el funcionamiento (exactitud y repetibilidad) durante el ordeño y a lo largo del tiempo de los 2 prototipos que obtuvieron mejores resultados en el Experimento 1 (P1 y P3), en función de la variable de CE utilizada obtenida a partir de los diferentes valores ofrecidos por el prototipo durante el ordeño on-line: media de máximos relativos (CE1) o máximo absoluto (CE2). Para ello se midió la CE de cada glándula de 24 cabras en el ordeño matinal, tomando datos durante 45 días consecutivos. Adicionalmente, se realizaron 4 controles para P1 con un intervalo entre ellos de 7, 15, 30 y 30 días, y 3 controles para P4 (P3 mejorado) con un intervalo entre ellos de 15, 30 y 30 días. En los ordeños existentes entre controles se emplearon los prototipos para el ordeño de animales, aunque solo se registró su lectura en los controles mencionados. El equipo que mejor comportamiento ofreció en el Experimento 1 para el ordeño de leche fresca de cabra fue P3, pues presentó una menor desviación típica de las lecturas (0,06 mS/cm vs 0,32 y 0,52 mS/cm para P1 y P2) y una estabilidad en la lectura de CE mas rápida. P2 fue el prototipo que ofreció los peores resultados en la lectura de la CE en leche de cabra. Se encontró que el diseño de la sonda de CE y temperatura juega un papel importante en el tiempo necesario para que se estabilice la lectura de la temperatura de la muestra analizada y por tanto de la CE, limitando, por tanto, el uso de algunas sondas en animales con poca producción láctea. Tras realizar el Experimento 2, a nivel de campo instalando P1 y P4 se concluyó que ambos prototipos obtuvieron resultados de repetibilidad similares, así como de evolución de lectura a lo largo del ordeño. Las dimensiones de la sonda son un factor limitante cuando la producción de leche de los animales es reducida, ya que un tamaño grande requiere de mayor volumen de leche para el llenado de la cámara de medición y reduce el número de lecturas tomadas durante el ordeño, cobrando mayor importancia en el caso de animales poco productores. El proceso de descalibración observado en ambos prototipos con el progreso del experimento, pone en duda su capacidad para la detección de mamitis, ya que el método se basa en detectar variaciones de CE debidas a la enfermedad (generalmente incrementos) que podrían verse enmascaradas por las variaciones propias del prototipo por motivos técnicos y no debidos al animal. Las 2 variables de CE obtenidas a partir de los diferentes valores ofrecidos por el prototipo durante el ordeño on-line (CE1 y CE2) podrían ser utilizadas indistintamente en los algoritmos de cálculo para detección de mamitis. En el Ensayo 3 se realizó un experimento con el fin de estudiar el efecto de la infección intramamaria en la CE de la leche individual de la glándula mamaria y evaluar el comportamiento de diferentes algoritmos de cálculo para la detección automática de mamitis. Para ello se realizaron lecturas diarias de CE y producción de leche de glándula en 8 cabras primíparas y 10 multíparas cuyas glándulas estaban libres de infección intramamaria. Tras un periodo de 3,5 semanas, en el que se controló el estado sanitario de las glándulas, se simularon varias situaciones desfavorables para salud de la glándula mamaria que pueden darse en explotaciones comerciales y que aumentan la exposición de los pezones a patógenos durante el ordeño, evaluando en días sucesivos el estado sanitario de las mismas. Confirmada la instauración de una infección intramamaria se continuó realizando análisis bacteriológicos y midiendo la CE, RCS y producción de leche durante otras 3,5 semanas. Adicionalmente, con los valores de producción y CE (tomados en los mismos controles mediante conductímetro de referencia y los prototipos P1 y P4) se estudió el comportamiento para la detección de mamitis(sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo) de diferentes algoritmos de cálculo basados en detectar desviaciones sobre el historial de CE o producción de leche de las glándulas medidas en ordeños consecutivos, muchos de ellos publicados en ganado vacuno para el mismo fin. La mamitis provocó un incremento significativo de CE en los días posteriores a la instauración de la infección tanto en las glándulas infectadas de animales infectados unilateralmente como bilateralmente, observándose un incremento de CE en las glándulas sanas colaterales a las infectadas, aunque las diferencias no llegaron a ser significativas. Este mismo efecto se observó para el RCS. Los microorganismos que provocaron un mayor incremento de CE fueron S. aureus, Bacilo Gram negativos y Estreptococos, no siendo relevantes los cambios provocados por el resto de microorganismos aislados (Estafilococos coagulasa negativos). En general, los mayores incrementos de CE, relacionados con un incremento de cloruros en leche, se observaron en los casos de infección bilateral, coincidiendo con los mayores incrementos de RCS. No se observaron diferencias significativas en la producción de leche entre el periodo previo y posterior a la infección. Los algoritmos de cálculo que mejores resultados ofrecieron de sensibilidad y especificidad con la medición de CE mediante un conductímetro de referencia fueron la desviación de 3 veces la desviación típica de la media móvil de 8 días previos (R1-mm8) (38 y 92%, respectivamente), el incremento del 5% sobre la media móvil de 4 días previos (¿5%-mm4) (23 y 96%, respectivamente), Promedio Móvil Integrado de Autorregresión (ARIMA) (30 y 96%, respectivamente), ARIMA de la diferencia de CE entre glándulas colaterales (ARIMA-DIFCE) (30 y 100%, respectivamente), ARIMA de la relación de CE entre glándulas colaterales (ARIMA RELCE) (30 y 100%, respectivamente). Estos algoritmos de cálculo ofrecieron peores resultados al considerar los valores de CE tomados por los prototipos, lo cual puede ser atribuible a la descalibración que sufren estos equipos. en la leche podría considerarse como un método útil para la detección de mamitis clínica o subclínica que llegue a provocar suficientes daños en la glándula mamaria como para producir cambios en la composición de la leche, principalmente de su contenido en minerales. Así mismo, dados los diferentes factores no infecciosos que afectan a la CE es necesario utilizar algoritmos de cálculo que consideren el historial de las lecturas diarias de CE de cada glándula y de otras variables, en la medida que sea posible su medición automática. Así mismo, y con el fin de recomendar el algoritmo de cálculo más apropiado para la detección de mamitis sería conveniente realizar un estudio más amplio, abarcando un mayor periodo de tiempo (lactaciones completas) y un mayor número de animales (a ser posible de diferentes granjas). Finalmente, deben utilizarse sensores de medición de CE de tipo sanitario, de menor tamaño con el fin de que puedan instalarse en los tubos cortos de leche o pezoneras para realizar medidas independientes de cada glándula mamaria y que, además, integren métodos de autocalibración.