Producción de resveratrol mediante cultivos de células vegetales de vid (Vitis vinifera L.cv. Gamay)escalado y diseño de biorreactores

  1. VERA URBINA, JUAN CARLOS
Supervised by:
  1. Roque Bru-Martínez Director
  2. Susana Sellés-Marchart Director

Defence university: Universitat d'Alacant / Universidad de Alicante

Fecha de defensa: 20 January 2012

Committee:
  1. María Ángeles Pedreño García Chair
  2. Margarita Juárez Sanz Secretary
  3. Juan Segura García del Río Committee member
  4. Antonio Asensio Calderón García Committee member
  5. Rosa María Cusido Vidal Committee member

Type: Thesis

Teseo: 320081 DIALNET

Abstract

El cultivo in vitro de plantas y células vegetales es una tecnología con gran potencial entre cuyas aplicaciones se encuentra la micropropagación de plantas, y en gran medida la producción de compuestos de interés comercial, tales como metabolitos secundarios, proteínas, polímeros biodegradables, vitaminas, aceites esenciales, etc. Los diferentes tipos de cultivo in vitro vegetal incluyen: el cultivo de callos, suspensiones celulares, semillas, meristemos, órganos (raíces), protoplastos, embriones y yemas. A partir de ellos pueden utilizarse diferentes estrategias para la obtención de metabolitos secundarios. El resveratrol es actualmente reconocido como una fitoalexina que se produce de forma natural en una gran variedad de plantas de forma constitutiva o en respuesta al estrés, lesión, irradiación ultravioleta e infección fúngica como parte del mecanismo de defensa de la planta. El resveratrol presenta dos formas isoméricas (cis- y trans-), el isómero trans- es normalmente más estable, siendo el que predomina en los tejidos vegetales. Al resveratrol se le han atribuido numerosas propiedades asociadas con la salud humana; entre las cuales destacan sus propiedades cardioprotectoras, anticancerígenas, antioxidantes, antiedad, antitumorales entre otras. Además de presentar aplicaciones en la agricultura debido a su actividad fungitóxica, fitoalexina y fitoanticipina. En la actualidad el trans-resveratrol es producido mediante el cultivo en campo de Polygonum cuspidatum (sin. Fallopia japonica); el compuesto se acumula en las raíces de donde se obtiene un extracto mediante métodos tradicionales de extracción. Debido a las propiedades farmacológicas y terapéuticas asociadas al resveratrol, se han buscado nuevas formas de producción desarrollándose diferentes métodos biotecnológicos basados en cultivos celulares vegetales y cultivos de microorganismos transformados con genes de la vía metabólica de plantas. En nuestro caso hemos utilizado suspensiones celulares de Vitis vinifera L. cv. Gamay para la producción de resveratrol (trans-resveratrol) implementando estrategias como la elicitación y el cultivo en biorreactores. Antes de proceder al escalado en biorreactores se llevaron a cabo una caracterización y optimización de la producción de trans-resveratrol a partir de suspensiones celulares de vid en matraces estudiando el efecto de variables propias del cultivo en biorreactores, como antiespumantes, régimen de iluminación así como las condiciones óptimas de elicitación. El inóculo óptimo para la producción de trans-resveratrol mediante elicitación con DIMEß se encuentra entre 19 al 26% -m/v- con una ratio óptima de 0,5 g DIMEß/g biomasa, limitada por una concentración máxima de DIMEß que puede causar daños irreversibles al cultivo. La utilización del antiespumante A-204 hasta al menos 0,03% (v/v) no tiene ningún efecto significativo sobre la producción de trans-resveratrol en el medio extracelular, lo que permite su empleo para el escalado en biorreactores. En respuesta a la elicitación con la combinación de DIMEß y MEJA las suspensiones celulares incrementaron sinérgicamente los niveles de acumulación de trans-resveratrol en el medio extracelular durante 7 días de elicitación, llegando a multiplicar por ocho la producción en relación a DIMEß solo. Las concentraciones ensayadas más productivas de los elicitores fueron 50mM DIMEß y 100¿M de MEJA alcanzando valores máximos de aproximadamente 4,18 mg.mL-1 y 16,3 mg.g biomasa-1 de concentración y producción especifica de trans-resveratrol extracelular respectivamente. Por otro lado, el escalado del cultivo en biorreactores de tipo comercial de 2 L (Biostat B) se logró caracterizar la producción de biomasa celular y la producción de trans-resveratrol mostró resultados similares a los obtenidos en matraces mientras que el biorreactor de diseño propio 2L (BAL-2L) en lo que respecta a la producción de trans-resveratrol fue muy similar al obtenido en el Biostat B, sin embargo, la obtención de cultivos de alta densidad se vio limitada por la aireación del cultivo lo que conllevó a una deficiencia de oxigenación y mezclado del cultivo. La mejora del diseño del biorreactor, denominado BAL-7L (biorreactor tipo columna de burbujeo) permitió cubrir las deficiencias encontradas en el diseño previo (BAL-2L). Dicho biorreactor permite el crecimiento de suspensiones celulares de vid Gamay y la producción de trans-resveratrol por elicitación con rendimientos comparables a los conseguidos con el Biostat B en un ciclo de producción. Además, este nuevo diseño permite realizar intercambio aséptico de medio de cultivo para procesos en dos etapas: etapa de crecimiento y etapa de elicitación; así como, la implementación de un sistema de operación por lote-alimentado para la producción de trans-resveratrol alcanzando al menos 3 ciclos de producción, el cual aumentó de forma sustancial la productividad. En lo que respecta a la recuperación de trans-resveratrol, se ha implementado un proceso mediante extracción líquido-líquido con acetato de etilo y posterior eliminación del disolvente que rinde un extracto seco con una riqueza de trans-resveratrol por HPLC de más del 95% y en peso de más del 70%. Asimismo, se ha implementado un proceso de purificación de trans-resveratrol mediante precipitación con MeOH 50%, que permite recuperar el 98% del trans-resveratrol contenido en el extracto seco, caracterizado por HPLC-UV/VIS-MS/MS, Infrarojo, Raman y RMN, con una pureza superior al 99 % en peso. La capacidad antioxidante del trans-resveratrol producido así como de derivados preparados por diversos métodos a partir del mismo (dímeros por adición de peróxido de hidrógeno a caldos elicitados, cis-resveratrol por fotoisomerización y dihidroresveratrol por reducción con H2 Pd/C) determinada mediante el ensayo ORAC con fluoresceína está entre de 4,4 y 5,7 veces la del estándar Trolox por unidad de masa. Las peroxidasas excretadas en los caldos catalizan la oxidación del resveratrol mediante la adición de peróxido de hidrógeno. Las peroxidasas de los cultivos tratados con DIMEß y DIMEß +MEJA presentan mayor Km para la oxidación del trans-resveratrol que las de los cultivos tratados sólo con MEJA y control, y por tanto mayor capacidad de responder a aumentos significativos de la concentración de trans-resveratrol.