Contribución de los genes angulata10 y apiculata2 a la morfogénesis foliar en arabidopsis thaliana

Resum

Esta Tesis forma parte de la disección genética del desarrollo foliar que se está llevando a cabo en el laboratorio de J.L. Micol. Hemos definido mediante análisis del ligamiento a marcadores moleculares las posiciones de mapa de 23 mutaciones que perturban la organogénesis foliar en Arabidopsis, que fueron inducidas con metanosulfonato de etilo. Hemos clonado así posicionalmente los genes mutados en angulata10-1 (anu10-1) y apiculata2 (api2), mutantes que hemos caracterizado en detalle. Las hojas de anu10-1 son pálidas, pequeñas y presentan indentaciones marginales prominentes. El mesófilo en empalizada de anu10-1 presenta menos células y de mayor tamaño que el tipo silvestre, así como grandes espacios intercelulares. Sus niveles de clorofilas a y b y de carotenoides son inferiores a los silvestres. También presenta un incremento en los niveles de H2O2, lo que sugiere que padece estrés fotooxidativo. Hemos establecido que ANU10 es At1g28530, un gen de copia única en Arabidopsis que está conservado en las plantas terrestres y que codifica una proteína de función desconocida. La expresión constitutiva del alelo silvestre de ANU10 en plantas anu10-1 portadoras del transgén 35Spro:ANU10 rescató completamente el fenotipo mutante. Hemos confirmado la identidad de ANU10 mediante ensayos de complementación con dos alelos insercionales de dominio público. Hemos visualizado el patrón de expresión de ANU10 concluyendo que se transcribe ubicuamente. Hemos generado un transgén portador de una fusión traduccional de ANU10 con la proteína GFP, comprobando que se localiza en las membranas tilacoidales de los cloroplastos de las hojas. Hemos detectado también la proteína ANU10:GFP en los amiloplastos de los ápices radiculares. Los cloroplastos de anu10-1 son pequeños y deformes, y presentan menos membranas tilacoidales y grana que el tipo silvestre. También están reducidos en anu10-1 los niveles de trímeros LHCII (Light-Harvesting Complex associated with photosystem II), que participan en la adhesión de membranas tilacoidales. Dado que el desarrollo foliar y la biogénesis de los cloroplastos se coordinan mediante señalización retrógrada, hemos estudiado la expresión de los genes LHCB1 (Ligh Harvesting Chlorophyll a/b Bibinding1), LHCB2, LHCB3 y HEMA1 (HEMIN A1), comprobando que es inferior a la silvestre; esto confirma que el fenotipo foliar de anu10-1 es consecuencia de las alteraciones funcionales y del desarrollo de sus cloroplastos. Los rasgos más conspicuos del mutante api2 son sus hojas apuntadas y una reducción del tamaño de la roseta y la estatura de la planta adulta. Hemos clonado posicionalmente el gen API2, que codifica la proteína ribosómica RPL36aB. El mutante api2 es portador de una transición G¿A en la región 5¿ no traducida del gen API2. Hemos aislado y caracterizado un alelo insercional de At3g23390, un parálogo de API2 que codifica la proteína RPL36aA, idéntica a RPL36aB. Hemos determinado mediante RT-PCR cuantitativa que la expresión de API2 está reducida en el mutante api2, y que rpl36aa es un alelo nulo. Hemos obtenido combinaciones dobles mutantes de api2 y rpl36aa con alelos de los genes AS1 (ASYMMETRIC LEAVES1) y AS2: resultaron sinérgicos los fenotipos de los dobles mutantes api2 as2-1 y rpl36aa as2-1, lo que indica que API2 y RPL36aA participan en el desarrollo foliar. Dos observaciones sugieren que al contenido de las células en proteínas RPL36a contribuye más RPL36aA que API2: el fenotipo de rpl36aa as2-1 es más extremo que el de api2 as2-1, y RPL36aA se expresa más del doble que API2 en el tipo silvestre. Hemos demostrado que API2 y RPL36aA son genes funcionalmente redundantes, tal como sugiere su idéntico patrón de expresión y la no complementación no alélica que muestra el diheterocigoto API2/api2;RPL36aA/rpl36aa, cuyo fenotipo es mutante. Esta pareja de parálogos manifiesta haploinsuficiencia combinada: cualquier genotipo con dos alelos silvestres y dos mutantes rinde un fenotipo mutante y son letales los de tres alelos mutantes y uno silvestre. Aunque los productos proteicos de API2 y RPL36aA son idénticos, sus secuencias codificantes presentan sustituciones nucleotídicas en el 34% de sus codones. Esto sugiere que las sustituciones no sinónimas han sufrido selección purificadora: han sido seleccionadas en contra durante la evolución de ambos parálogos. El bajo cociente entre la tasa de sustituciones no sinónimas y sinónimas de API2 y RPL36aA, así como otros grupos de parálogos que codifican proteínas ribosómicas idénticas, sugiere que la selección purificadora y la haploinsuficiencia combinada son las causas principales de la retención de los genes duplicados que codifican proteínas ribosómicas en las plantas. Hemos obtenido además la secuencia completa del genoma de los mutantes anu1-1, anu4-1, anu9-1, anu12, apiculata7-1 (api7-1), scabra1 (sca1) y sca5. El análisis bioinformático de las lecturas obtenidas nos ha permitido identificar mutaciones en los intervalos candidatos previamente definidos mediante análisis de ligamiento; anu1-1, anu4-1, anu9-1 y anu12 han resultado ser nuevos alelos de genes previamente descritos, que codifican proteínas del cloroplasto. Nuestros resultados demuestran que la resecuenciación de genomas de Arabidopsis es un abordaje útil para la identificación de un número relativamente bajo de mutaciones candidatas, entre ellas la que causa el fenotipo de interés, incluso en fondos genéticos diferentes del de referencia.