Role of plastid markers in environmental studies on the example of the endangered species Cistus heterophyllus

Resumo

Los marcadores moleculares son una herramienta muy poderosa en muchos campos como la filogenia, la biología evolutiva o la conservación. Sin embargo, no es una tarea fácil encontrar marcadores adecuados para especies raras. Los marcadores ideales tienen que ser de carácter informativo dependiendo de la cuestión biológica: la diferenciación entre especies estrechamente relacionadas requiere un marcador para regiones altamente diferenciados, mientras marcadores para la diferenciación entre organismos pertenecientes a familias distantes están seleccionados para la detección de regiones conservadas. Importante es también el tipo de ADN como fuente de nuestro marcador. El ADN de plástidos se prefiere en proyectos sobre filogenia, mientras que la detección de eventos de hibridación demanda el análisis del ADN nuclear. Sin embargo, en el caso de especies raras, los científicos se encuentran con una falta de información sobre secuencias de los genomas bajo estudio. En este caso la única solución es la aplicación de marcadores universales, ya descritos para otros organismos. Este proyecto tiene como objetivo analizar un conjunto de marcadores moleculares para el rastreo de eventos de hibridación en la población de una especie en peligro de extinción de la familia Cistaceae, Cistus heterophyllus subsp. carthaginensis. La distribución de esta subespecie se limita a una sola población natural en el sureste de España, donde co-ocurren individuos con fenotipo silvestre y fenotipos híbridos, lo que sugiere eventos de hibridación entre esta población en peligro de extinción y una especie localmente abundante, Cistus albidus. Estos híbridos se han descrito en África como C. × clausonis. Se realizaron búsquedas de regiones de ADN que permiten la discriminación de entre los individuos de tipo silvestre e híbridos supuestos. Los datos generados podrían mejorar la estrategia de conservación de las especies con el fin de evitar su extinción. En el capítulo 1, se describe la posible aplicación de marcadores moleculares plastídicos, regiones de marcadores conocidas como “códigos de barras”, para su aplicación de la población mencionado anteriormente. Regiones no codificantes de ADN (rbcL, trnK-matK) no resultaron lo suficientemente variables para ser informativas en individuos estrechamente relacionados. Regiones intra-específicas (trnL-F, trnH-psbA) presentan una alta tasa de cambios evolutivos, indicado por su alto grado de variabilidad. Sin embargo, encontramos que estos marcadores no son suficientemente estables como para proporcionar información fiable para la diferenciación entre individuos silvestres e híbridos. Sorprendentemente, se observó para los genes rpoB y rpoC1 una heteroplasmia en C. heterophyllus y C. × clausonis local, pero no en C. albidus u otra especie comun a esta región, C. monspeliensis. Encontramos dos alelos distintos de rpoB, uno presente en todas las especies y un segundo presente sólo en C. heterophyllus y C. × clausonis local. También se detectaron dos alelos de rpoC1, uno común a todas las especies analizadas y un segundo presente sólo en C. × clausonis local. Nuestros resultados muestran que hay un alelo rpoB distintivo y común a C. heterophyllus y C. × clausonis de África y Europa. El alelo rpoC1 unicamente encontrado en C.× clausonis local indíca un origen de esta pequeña población diferente que no resulta de una hibridación entre los C. albidus o C. heterophyllus actualmente presentes en esta ubicación. El capítulo 2 describe la aplicación de regiones internas inter-espaciadas (ITS, internal transcribed spacer) ribosomales. Estos marcadores altamente polimórficos permiten la construcción de árboles filogenéticos moleculares con el objetivo de analizar las relaciones entre poblaciones geograficamente aislados de Cistus heterophyllus, Cistus albidus y posibles híbridos entre estos dos especies, C. × clausonis de África y de Europa. Nuestros datos indican que, depnediendo de individuo o población, C. × clausonis filogenéticamente parece más a Cistus heterophyllus o Cistus albidus y problamente está relacionado a la homogenización de variación por evolution concertada. En el capítulo 3, se presenta un problema que surgió durante el análisis de los datos de PCR cuantitativa de los marcadores de código de barras. Como resultaron diferencias significativas entre especies en la eficiencia de la PCR aplicando el mismo marcador molecular, decidimos investigar si el sesgo observado podría perturbar la identificación de especies durante el metabarcoding de muestras. Utilizamos seis loci universales y 48 especies de plantas y cuantificamos el posible sesgo en cada paso del proceso de identificación desde PCR apunto final hasta la secuenciación. La amplificación a punto final fue significativamente diferente para un solo loci y entre las especies. Análisis por PCR cuantitativa reveló que el umbral Cq para diversos loci, incluso dentro de una sola extracción de ADN, mostró una diferencia de 2000 veces en la cantidad de ADN obtenida después de la amplificación. Experimentos de secuenciación de próxima generación (NGS) en nueve especies mostraron sesgos significativos hacia especies y loci específicos utilizando cebadores específicos del adaptador. El sesgo durante la secuenciación NGS se puede predecir en cierta medida por los valores Cq de amplificación en qPCR y depende de la secuencia primaria de ADN. http://repositorio.bib.upct.es/dspace/