Analysis othe circadian clock and its role in scent emission in antirrhinum majus and petunia hybrida

Resumen

Resumen de la tesis: [ESP] Los organismos están adaptados a cambios cíclicos y ambientales, tales como las mareas, la alternancia día-noche o el paso de las estaciones. Este sistema innato que registra dichos cambios se denomina reloj biológico, consiste en una red de genes y proteínas. Los genes reloj conforman bucles interconectados y mutuamente regulados. La anticipación a los cambios periódicos permite a los organismos ajustar su metabolismo secundario, crecimiento o reproducción. In plantas, el modelo más simple descrito hasta la fecha se encuentra en la picoalga Ostreococcus tauri, que solo posee dos genes reloj: CIRCANDIAN CLOCK ASSOCIATED 1 y TIMING OF CAB EXPRESSION 1. El análisis de especies como Arabidopsis thaliana reveló la existencia de una red más compleja, incluyendo a la familia de los PSEUDO-RESPONSE REGULATORS, el complejo de la tarde y los receptores de luz azul ZEITLUPE y FLAVIN KELCH F-BOX PROTEIN 1 entre otros. Un ejemplo de un carácter controlado por el reloj circadiano en plantas con flor es la emisión de aromas, la cual muestra un patrón diario, incluso bajo condiciones de luz u oscuridad constante, una característica de los procesos controlado por el reloj circadiano. Aunque la biosíntesis de volátiles ha sido ampliamente estudiada, la regulación por parte del reloj circadiano continúa siendo poco conocida. En el presente trabajo hemos seguido dos aproximaciones con el objetivo de entender mejor el reloj circadiano y los procesos controlados por el reloj circadiano. Primero, analizamos y caracterizamos la estructura de los genes reloj en hojas y pétalos de petunia (Petunia hybrida) bajo dos condiciones de luz diferentes. Mostramos que los genes PSEUDO RESPONSE REGULATOR 7, 5 y GIGANTEA están duplicados en petunia y los patrones de expresión génica variaron entre hojas y pétalos, la mayoría de genes mostraban su máximo durante la fase de luz y durante la fase de oscuridad en pétalos. Cuando las plantas se transfirieron a oscuridad continua, los genes reloj tendieron a retrasar su máximo de expresión en ambos tejidos. Sin embargo, LATE ELONGATED HYPOCTYL, un gen altamente conservado en el linaje verde, no varió su patrón de expresión, independientemente del tejido o de las condiciones de luz. Además, encontramos que la variabilidad en la expresión génica en hoja y pétalo dependió de la hora del día. Con referencia a la variabilidad de expresión, en condiciones de luz-oscuridad la mayoría de genes analizados en hoja mostró su mayor estabilidad durante el periodo luminoso mientras que el pétalo mostró su estabilidad en la oscuridad. En general, cuando bajo condiciones de oscuridad constante, la variabilidad aumentó en ambos tejidos. Hemos realizado un detallado análisis del efecto del silenciamiento de dos genes reloj en el crecimiento, fenotipo de la flor y la emisión de aromas. Silenciamos CHANEL (PhCHL), un ortólogo de ZEITLUPE, en petunia y LATE ELONGATED HYPOCOTYL (AmLHY) en boca de dragón (Antirrhinum majus). La expresión de PhCHL en hojas y pétalos difirió cuando las plantas se aclimataron a días cortos, caracterizado por una expresión PhCHL avanzada en pétalos. Las líneas silenciadas RNAi:PhCHL eran más pequeñas que las silvestres y el análisis del crecimiento reveló que la tasa de crecimiento de tallo y flor era más lenta en plantas RNAi:PhCHL. Observamos también diferencias en la emisión de aromas diaria entre líneas no transgénicas y RNAi:PhCHL, en el perfil de aromas y en el tiempo de emisión. Mientras que la emisión de la mayoría de los volátiles, incluyendo el benzoato de etilo o acetofenona, disminuyó en las líneas transgénicas, otros aumentaron incluyendo benzaldehído y fenilacetaldehído aumentó en las plantas RNAi:PhCHL. Además en las líneas RNAi, algunos compuestos como el benzoato de etilo mostraron un fenotipo de emisión adelantada y el benzoato de bencilo, una emisión tardía. En el caso de las líneas RNAi:AmLHY de boca de dragón, el silenciamiento de AmLHY disminuyó la velocidad de crecimiento de la flor, pero no afectó al tamaño final de la flor. El perfil aromático en las líneas silenciadas estuvo caracterizado por un porcentaje mayor de linalool y ocimeno, mientras que otros volátiles como el 3,5-dimetoxitolueno, nonanal y decanal disminuyeron. Curiosamente, encontramos compuestos tales como los bencenoides benzoato de metilo y salicilato de metilo y los monoterpenos mirceno y ocimeno que mostraron una emisión tardía, mientras que la emisión máxima del fenilpropanoide cinnamato de metilo fue avanzada en comparación con el silvestre. De la presente tesis, podemos esbozar unas conclusiones generales. Primero, la transcripción del reloj circadiano es tejido específico, lo cual podría estar relacionado con funciones especializadas como la apertura de estomas en hojas o la emisión de volátiles en pétalos. Segundo, la variación en expresión génica o ruido transcripcional dependió del tejido, hora del día y condiciones de luz-oscuridad. Finalmente, el aroma floral depende de la contribución o cantidad de cada volátil y del número y clase de volátiles. Este perfil aromático varió a lo largo del día y está controlado por el reloj circadiano. Los genes reloj son necesarios para mantener la composición y tiempo de emisión. Otro aspecto interesante es que el gene AmLHY reguló la biosíntesis de volátiles en diferentes puntos: compuestos que derivan del ácido benzóico como benzoato de metilo y el salicilato de metilo mostraron una emisión tardía mientras que los monoterpenos mirceno y ocimeno adelantaron su emisión. [ENG] Organisms are adapted to cyclic environmental changes, such as tidals, day-night alternance or seasonality. An innate timing device that registers these changes is called biological clock. Circadian clocks are comprised of interlocked regulatory loops of genes and proteins. Anticipation to periodic changes allows organisms to adapt their secondary metabolism, growth or reproduction. In plants, the simplest model found to date is the picoalga Ostreococcus tauri, which has only two clock genes: CIRCANDIAN CLOCK ASSOCIATED 1 and TIMING OF CAB EXPRESSION 1. The analysis of species as Arabidopsis thaliana revealed the existence of a more complex net of clock elements, including the PSEUDO-RESPONSE REGULATORS family, the evening complex and the blue light receptors ZEITLUPE and FLAVIN KELCH F-BOX PROTEIN 1, among others. An example of a character controlled by the circadian clock in flowering plants is scent emission, which shows a daily pattern even under constant light or dark conditions, a characteristic feature of processes controlled by the circadian clock. Although the volatile biosynthesis has been widely characterized, the regulation by the integration of external cues, such as light or temperature, is still poorly understood. In the present work we followed two approaches in order to get a better understanding about circadian clock structure and processes controlled by the circadian clock. First, we characterized and compared the structure of circadian clock genes in leaves and petals of petunia (Petunia hybrida) under two different light conditions. We show that the clock genes PSEUDO RESPONSE REGULATOR 7, 5 and GIGANTEA are duplicated in petunia and that the gene expression patterns differ in leaves and petals with most genes peaking during the light phase in leaves and during the dark phase in petals. One of the petunia duplicated paralogs PaxiNPRR5a from P.axillaris and PinfSPRR5a from P.inflata have lost the canonical repression domain indicating a departure of their function from a standard transcriptional repression. When plants where transfered to constant darkness, clock genes tended to delay their maximum expression in both tissues. However, LATE ELONGATED HYPOCOTYL, which is a highly conserved gene across the green lineage, did not vary its expression pattern, regardless of the tissue or light conditions. We found that gene expression variability in leaves and petals depended on the time of the day. We studied the variability of expression and under light:dark condition, most analyzed genes showed their highest stability during the light period in leaves, whereas in petals, stability was higher during the dark period. In general, when petunia was kept under constant darkness, the variability increased in both tissues. In a second approach, we performed a detailed analysis of the effect of silencing two clock genes on growth, flower phenotype and scent emission. We silenced CHANEL (PhCHL), a ZEITLUPE ortholog, in petunia and LATE ELONGATED HYPOCOTYL (AmLHY) in snapdragon (Antirrhinum majus). The expression of PhCHL in leaves and petals differed when plants were acclimated to short days, characterized by an earlier expression peak in petals. RNAi:PhCHL silenced lines were shorter than wild-type plants and growth analysis revealed that stem and flower growth rate was slower. We also observed differences in the daily scent emission between non-transgenic and RNAi:PhCHL lines, both concerning the amount of scent emission, the scent profile and the timing of emission. While the emission of most volatiles, including ethyl benzoate and acetophenone, decreased in the silenced lines, others increased including benzaldehyde and phenylcetaldehyde. This differing effect was also found for timing as ethyl benzoate, displayed an early scent-emission phenotype while benzyl benzoate, displayed a delayed emission. In case of RNAi:AmLHY snapdragon lines, down-regulation of AmLHY led to a decrease in the flower growth speed, even so final flower size was not affected. The floral scent profile in silenced lines was characterized by a higher percentage of linalool and ocimene, whereas other volatiles such as 3,5-dimethoxytoluene, nonanal and decanal decreased. Interestingly, compounds such as the benzenoids methyl benzoate and methyl salicylate and the monoterpenes myrcene and ocimene showed a delayed emission, whereas maximum emission of phenylpropanoid methyl cinnamate was advanced compared to wild-type. The present work leads to several general conclusion: first, the circadian clock transcriptional structure is tissue specific, and this specificity may be related to specialized functions perfomed in the different tissues, such as stomata opening in leaves or volatile emission in petals. Second, the variation in gene expression as well as the transcriptional noise depended on the tissue, day time and light:dark conditions. Finally, the floral aroma, in terms of contribution and amount of every single compound as well as number and class of volatiles, is controlled by the circadian clock. Circadian clock genes are involved in the maintainance of composition and timing of emission. Another interesting aspect is that the clock gene AmLHY regulated volatile biosynthesis at the biosynthetic pathway level: the compounds that derive from benzoic acid, such as methyl benzoate and methyl salicylate, displayed a delayed emission whereas the monoterpenes myrcene and ocimene advanced their emission. http://repositorio.bib.upct.es/dspace/