Virus del mosaico del pepino dulce (Pepmv)desarrollo de un vector viral e identificación de un mutante de tomate de pérdida de susceptibilidad

Zusammenfassung

Resumen de la tesis: El virus del mosaico del pepino dulce (pepino mosaic virus, PepMV; género Potexvirus) es un virus de RNA monocatenario de sentido positivo que causa una grave enfermedad que afecta a cultivos intensivos de tomate de todo el mundo, provocando importantes pérdidas económicas. A pesar de los esfuerzos realizados por diversos grupos de investigación, no existen variedades comerciales de tomate que porten resistencia a PepMV, lo que hace necesaria la identificación de nuevas fuentes de resistencia a este virus. Además, PepMV tiene también un importante interés biotecnológico. Por otro lado, el desarrollo y mejora de nuevas herramientas moleculares basadas en PepMV puede ser útil para la investigación de diversos aspectos básicos de la interacción virus/huésped. En el capítulo I se describe el proceso de mejora de la estabilidad de algunos de los vectores basados en PepMV ya existentes, y el desarrollo de nuevos vectores virales basados en PepMV capaces de expresar diferentes genes reporteros tanto en N. benthamiana como en tomate. El vector PepGFP2a (Sempere et al., 2011) expresaba GFP de forma eficiente y estable en N. benthamiana, pero no en tomate. En este trabajo, en primer lugar se ha evaluado la estabilidad de dos variantes de PepGFP2a, denominadas PepGFPm1 y PepGFPm2, en las que se redujo progresivamente el número de nucleótidos duplicados en la región que codifica el extremo N-terminal de la proteína de la cápsida. Estos vectores mejoraron los niveles de expresión de GFP además de su estabilidad pero solo en N. benthamiana, no en tomate. Bajo la hipótesis de que un cambio de gen reportero podría conferir una mayor estabilidad del transgén en plantas de tomate, se remplazó el gen GFP por DsRed o mCherry creando dos nuevos vectores, PepDsRed y PepmCherry, respectivamente; mientras que el comportamiento de PepmCherry fue similar al de PepGFPm2, PepDsRed fue capaz de expresar el gen reportero de forma eficiente tanto en N. benthamiana como en tomate. El uso de PepGFPm2 y PepDsRed permitió la localización de PepMV en células de ambos huéspedes, además de la observación mediante el microscopio de barrido láser confocal de unos cuerpos fluorescentes característicos de células infectadas, posiblemente los complejos de replicación de PepMV. Para completar el set de vectores virales basados en PepMV, se construyó un vector que expresaba el gen BAR de resistencia a herbicida, útil para escrutinios masivos de susceptibilidad. En el capítulo II de este trabajo se describe el proceso de identificación de un nuevo gen candidato a codificar un factor de susceptibilidad a PepMV mediante una estrategia de genética directa rápida. Para ello, en primer lugar se realizó un escrutinio masivo de mutantes de tomate, dando lugar a la identificación del mutante 2F531, que mostró ausencia de síntomas y una drástica reducción de la acumulación de cuatro aislados de PepMV. El empleo de PepDsRed mostró también una reducción significativa de la intensidad de fluorescencia en el mutante, acompañado de un retraso en el establecimiento y/o diseminación de la infección. Un ensayo de pases seriados mostró que la resistencia no se superó durante al menos 5 pases, lo que sugiere que pueda ser duradera en campo. Análisis genéticos de esta resistencia confirmaron el carácter monogénico y recesivo de la misma. Mediante el empleo de una estrategia de mapeo por secuenciación, se identificó una región de 2,02 Mb en la parte distal del cromosoma 2 en la que se localizaron 9 mutaciones asociadas con la resistencia, 4 de ellas localizadas en genes. La naturaleza de las mutaciones identificadas en los genes anotados en esta región cromosómica, así como un análisis de RNA-seq, fueron utilizados para identificar al principal candidato a codificar un factor de susceptibilidad a PepMV. http://repositorio.bib.upct.es/dspace/