Avances en las propiedades de biocatalizadores: diseño y obtención de materiales mesoporosos ordenados como soportes para la inmovilización no covalente de enzimas

Resumen

En este trabajo se aborda de forma multidisciplinar la obtención de biocatalizadores mediante el diseño y síntesis de materiales mesoporosos ordenados como soportes a medida para la inmovilización de enzimas con distintas características. Se han obtenido novedosos materiales silíceos e híbridos organosilíceos de tipo MMO (Materiales Mesoporosos Ordenados) diseñados a partir de las características de dos enzimas con distintas actividades y propiedades: Lacasa de Myceliophthora thermophila, una oxidorreductasa multicobre que cataliza la oxidación de diferentes compuestos fenólicos, aminas y ligninas, tiene un peso molecular de 110 KDa y un punto isoeléctrico de 4,2, y lipasa de Candida antarctica B encargada de la hidrólisis de triglicéridos a ácidos grasos libres y glicerol, su peso molecular es 32 KDa y su superficie presenta un dominio hidrofóbico. En la presente tesis doctoral se han sintetizado materiales silíceos mesoporosos ordenados avanzados, con poros de tipo canal, para la inmovilización post-síntesis y estabilización de lacasa. Estos materiales poseen una elevada superficie específica y estrecha distribución de tamaño de poro, que resultan de un sistema ordenado de mesoporos de simetría definida. Los materiales puramente silíceos se utilizaron como soportes para estudiar las características morfológicas de las partículas y los canales de los poros más adecuadas para inmovilizar lacasa. La funcionalización con grupos orgánicos para aumentar la afinidad química hace necesaria la obtención de poros de mayor diámetro para permitir una buena difusión del enzima que permita alcanzar altos valores de carga enzimática. El tamaño de poro se ha adaptado a las dimensiones moleculares de la enzima lacasa adecuando las condiciones de síntesis y mediante la adición de moléculas orgánicas que actúan de expansores de las micelas de surfactante que actúan de plantilla de la estructura porosa. Para la inmovilización de lacasa, la superficie de estos materiales se ha modificado incorporando cadenas orgánicas que contienen grupos funcionales de tipo amino, capaces de interaccionar electrostáticamente con la enzima en unas condiciones de pH adecuadas. Esta funcionalización orgánica se ha realizado tanto por anclaje (posterior a la síntesis de la estructura de sílice) como por cocondensación (incorporación directa durante la síntesis). Además, se han sintetizado novedosas organosílices periódicas mesoporosas que incorporan dentro de la propia pared del soporte tanto el grupo etileno para la inmovilización de lipasa, como grupos amino para la inmovilización de lacasa, y con un diámetro de poro suficientemente grande para inmovilizar a las enzimas. Se han obtenido biocatalizadores con altas cargas enzimáticas y elevada actividad catalítica en los que los tamaños de poro están ajustados a las dimensiones de la enzima (confinamiento), y en los que la afinidad química enzima-soporte es alta (interacciones hidrofóbicas con lipasa y electrostáticas con lacasa). La conjunción de estas dos propiedades contribuye a la retención prácticamente irreversible de las enzimas en el interior de los entramados porosos de los soportes, dificultando o incluso eliminando el lixiviado de las enzimas, a pesar de la naturaleza no covalente de la unión al soporte. La inmovilización mejora la estabilidad de las enzimas lacasa y lipasa en presencia de etanol y metanol, respectivamente. También, se ha desarrollado una estrategia para inmovilizar la enzima en el interior del material mesoporoso durante la propia etapa de síntesis (inmovilización in-situ). Esto permite encapsular la enzima lacasa en sistemas con poros de tipo caja-ventana, en los que las cajas de grandes dimensiones que contienen la enzima, están comunicadas entre sí por ventanas estrechas, de menor diámetro que las dimensiones de la enzima. La enzima queda retenida en el interior de las cajas, evitando cambios estructurales de las enzimas y protegiéndola del medio externo. Para la encapsulación in-situ de la enzima dentro de los materiales silíceos mesoporosos se ha requerido un profundo estudio del uso de diferentes surfactantes, aditivos y condiciones de síntesis para obtener la encapsulación de lacasa sin que el medio de síntesis produzca la desactivación de la misma. La adecuada selección de los surfactantes y aditivos ha sido un factor clave para obtener micelas diferentes alrededor de las moléculas de enzimas que actúan como plantillas del sistema, y que permiten obtener materiales silíceos mesoporosos que contienen moléculas de enzima en su interior. Finalmente, por primera vez se ha conseguido mediante estudios avanzados de microscopía electrónica de transmisión (STEM-HAADF-EELS con aberración corregida) localizar directamente a las enzimas en el interior de los poros y cavidades de los soportes.