Especies reactivas de oxígeno y genotecas sustractivas en la interación capsicum annuum-phytophthora capsici

Resumen

La tesis doctoral que lleva por título "Especies reactivas de oxígeno y genotecas sustractivas en la interacción Capsicum annuum-Phytophthora capsici, ha sido realizada por la Licenciada en Bioquímica María Emilia Requena Candela y dirigida por la Dra. Mª Emilia Candela Castillo, Catedrática de Fisiología Vegetal del Departamento de Biología Vegetal de la Universidad de Murcia y la Dra. Catalina Egea Gilabert Profesora Titular de Fisiología Vegetal del Departamento de Ciencia y Tecnología Agraria de la ETSIA de la Universidad Politécnica de Cartagena. Murcia, 2010 El objeto de esta investigación es el estudio de las reacciones defensivas que ocurren después de la interacción entre dos variedades de Capsicum annuum (una sensible, California Wonder (CW) y otra resistente, Serrano Criollo de Morelos (SCM)) y el oomiceto patógeno Phytophthora capsici utilizando técnicas bioquímicas, fisiológicas, de Biología Molecular y herramientas bioinformáticas. La investigación se ha centrado tanto en ensayos realizados in vitro mediante cultivos de células en suspensión, como en ensayos realizados in vivo en el tallo de la planta, donde se producen las reacciones defensivas que van a determinar el que una variedad sea resistente o sensible al oomiceto. Uno de los objetivos que se incluyen en el Plan de trabajo consiste en obtener ESTs mediante hibridación sustractiva entre tejidos sano e infectado (a partir de tallos) y conservar los restantes en una genoteca para localizar la expresión de genes relacionados con la resistencia. La metodología incluye realizar una sustracción de aquellos genes que tenga que ver con la expresión sin infección (CW-control) frente a los que se expresan cuando hay resistencia en la variedad infectada (SCM-inf). La variedad sensible presentará los genes de crecimiento, desarrollo y los debidos a las heridas, mientras que la variedad resistente presentará estos genes, los del hongo y los que se expresan cuando hay resistencia. La sustracción dejará los relacionados con la resistencia, los del hongo y otros propios de cada variedad que no estén en la otra. La aplicación de la bioinformática nos permitirá caracterizar las posibles proteínas que se deriven de fragmentos de genes relacionados con la resistencia de la variedad SCM a P. capsici. Otro de los objetivos de esta tesis es el estudio fisiológico de componentes de la resistencia temporal y espacial. Para analizar la resistencia en relación con el tiempo de respuesta, se utilizan suspensiones celulares elicitadas con filtrados del cultivo del oomiceto y para analizar la respuesta espacial se utilizan tallos infectados en los que medir la profundidad de la penetración del micelio del patógeno y enzimas antioxidantes, así como el anión superóxido y el peróxido de hidrógeno mediante técnicas bioquímicas y microscópicas. Se concluye en esta Tesis doctoral, que cuando se elicitan suspensiones de las variedades estudiadas CW y SCM de pimiento, con el oomiceto P.capsici, estas sufren una reacción de hipersensibilidad (HR) y sufren necrosamiento que se mide como pardeamiento. Las células en suspensión elicitadas con P. capsici y teñidas con NBT para analizar producción de anión superóxido (O2-) demuestran: (i) que se forma y de manera instantánea en ambas variedades de pimiento, (ii) que no aumenta con el tiempo de elicitación y (iii) que siempre es mayor en la variedad resistente SCM. Cuando se tiñen con DAB para analizar producción de peróxido de hidrógeno (H2O2) se demuestra que se forma y de manera instantánea en ambas variedades de pimiento y que aumenta con el tiempo de elicitación pero sólo en la variedad resistente SCM. También se demuestra un aumento de la conductividad, de pH y de la fitoalexina Capsidiol, siempre mayor en la variedad SCM que en la sensible CW, parámetros que son indicativos de la resistencia que las células de SCM presenta ante la infección. También hay una intensa producción de peroxidasas, siempre mucho mayor en SCM. En los ensayos realizados en los tallos, para analizar espacialmente la respuesta de las plantas CSM y CW a P.capsici se mide la longitud de necrosis y se comprueba que a los 6 días la necrosis se detiene en SCM, por tanto esta variedad es capaz de detener el avance del oomiceto, mientras que en CW continua hasta invadir todo el tallo y matar la planta. En los tallos elicitados se mide anión superóxido y peróxido de hidrógeno y enzimas antioxidantes. Obtenemos que se producen tanto H2O2 como O2- en ambas variedades pero siempre en mayor concentración en SCM. Los cortes sucesivos y descendentes hechos en la zona intermedia (de 200 micras de espesor) nos muestran que hay una mayor intensidad de DAB (tiñe el peróxido de hidrógeno) en las primeras secciones de la variedad resistente y que disminuye a medida que avanzamos por la zona intermedia, desde la zona adyacente a la necrosis hasta la sana. La tinción se localiza en las células del xilema y adyacentes hasta la sección 6, luego disminuye y en la sección 10 la tinción se localiza en las células del floema. Por tanto, el peróxido de hidrógeno se comporta como un segundo mensajero interviniendo en la señalización de la invasión patógenica a lo largo del xilema en SCM. En CW la intensidad de DAB es menor en el xilema y sin embargo es más intensa en el floema y desde la sección 2. A partir de la sección 7 la intensidad es muy baja con lo cual el peróxido de hidrógeno tiene un papel débil en la señalización de la infección, en esta variedad. Hasta donde sabemos, es la primera vez que se detecta un sistema de señalización de la infección patogénica, en la cual está implicado el O2- y el H2O2 en plantas de pimiento infectadas con Phytophthora capsici y no está documentada la importancia que tiene el que circule por el xilema o por el floema. Con la técnica de hibridación sustractiva (SSH) aplicada con éxito en las plantas de pimiento infectados con el patógeno P. capsici, se han obtenido 3700 clones de los cuales se secuenciaron 108 que se alinean en 29 contig (ESTs). Uno de los EST encontrado, el 1A1, presenta una alta homología con una secuencia aminoacídica de un precursor de peroxidasa de Ricinus communis empleando la base de datos NCBI y la herramienta de búsqueda Blastx. 1A1 es homologo en un 90 % (16 de 19 proteínas) a la cadena A de peroxidasa de diferentes especies empleando la base de datos PDB y además 1A1 tienen un status alto de similitud con dos proteínas peroxidasas de plantas según la base de datos PeroxiBase. Todo esto permite que se identifique nuestro EST con una peroxidasa, con una elevada probabilidad de acierto. Esta peroxidasa (1A1) está relacionada con la reacción defensiva de Capsicum frente al patógeno, siendo la primera vez que se relaciona un gen de peroxidasa, a nivel genético, con la resistencia de Capsicum annuum frente a Phytophthora capsici.