Dinámica de la acetilación de "Escherichia coli" para mejorar sus capacidades biotecnológicas

Resumen

E. coli es uno de los microorganismos más utilizados con fines biotecnológicos y como modelo de investigación, pues ha sido ampliamente estudiado y se conoce su genoma completo, así como su proteoma y transcriptoma. Sin embargo, el uso de E. coli como organismo huésped en bioprocesos (producción de proteínas recombinantes) puede conllevar una serie de inconvenientes, como la carga metabólica, el desbordamiento del acetato y el conocimiento limitado de algunas de sus modificaciones postraduccionales, como la acetilación de lisinas. La Nε-acetilación de las lisinas es una modificación postraduccional que está relacionada con el metabolismo del acetato a través de los intermediarios acetil-CoA y acetil-P, que actúan como dadores de acetilos. Esta modificación se produce en muchas enzimas del metabolismo central y está implicada en la regulación de los procesos metabólicos, los procesos de traducción, la localización celular y las interacciones de las proteínas con otras moléculas. El principal objetivo de esta Tesis Doctoral fue comprender los factores que gobiernan la dinámica de la acetilación de proteínas y su efecto sobre el control del metabolismo central de E. coli, con el fin de diseñar estrategias que garanticen la optimización celular para la producción de proteínas recombinantes. Así, se estudiaron las implicaciones del uso de distintos medios de cultivo en la producción de proteínas recombinantes, y en el perfil proteico y el nivel de acetilación en E. coli (Capítulos 3 y 6). Además, también se emplearon distintos sistemas de expresión y cepas deficientes en genes involucrados en el metabolismo del acetato y en la acetilación de lisinas, para optimizar la producción de proteínas recombinantes y conocer su nivel de acetilación (Capítulos 3 y 4). Por último, se estudiaron las implicaciones de la acetilación en una importante ruta metabólica, la ruta de biosíntesis de pirimidinas de novo (Capítulo 5). Los resultados obtenidos permitirán diseñar estrategias racionales, tanto por ingeniería de cepas como por la selección de medios de cultivo, para aumentar las capacidades biotecnológicas de la bacteria y conocer las implicaciones de la acetilación en estos procesos. A partir de los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral, las principales conclusiones extraídas son: 1) La producción de proteínas recombinantes se ve favorecida utilizando un medio complejo y glicerol como fuente de carbono. 2) La utilización de la cepa ΔackA supone una reducción en el desbordamiento del acetato y un aumento de 5 veces en la producción de proteínas recombinantes cuando se emplea el sistema de expresión óptimo. 3) La carga metabólica producida por la transcripción de los vectores de expresión conduce a una disminución de la producción de proteínas recombinantes cuando se emplean sistemas de expresión de alto número de copias con promotores fuertes. 4) La ruta de biosíntesis de pirimidinas de novo es regulada por la acetilación de lisinas en la enzima OPRTasa. La acetilación de la OPRTasa en las lisinas 26 y 103 produce una disminución de la actividad que puede ser revertida por la desacetilasa CobB. 5) La abundancia relativa de proteínas en E. coli depende de las condiciones de cultivo, y la identidad y el número de lisinas acetiladas depende de la abundancia relativa de las proteínas. 6) El nivel de acetilación en E. coli depende principalmente del desbordamiento de acetato, siendo mayor en medio complejo. 7) Se han encontrado lisinas con diferencias en su nivel de acetilación entre las distintas condiciones de cultivo en el ciclo del glioxilato, el ciclo de los ácidos tricarboxílicos y la asimilación del nitrógeno, por lo que estas vías podrían estar reguladas por acetilación de forma diferencial. En conclusión, los resultados de esta Tesis Doctoral ponen de manifiesto la interconexión de la regulación por acetilación de las rutas del metabolismo central con las condiciones de cultivo en E. coli. Por lo tanto, el empleo de distintas condiciones de cultivo determina los flujos del metabolismo central en general, y en concreto del desbordamiento del acetato, lo que tiene repercusiones en la abundancia relativa de las proteínas, en el nivel de acetilación de lisinas y, en consecuencia, en la producción de proteínas recombinantes.