Mecanismos de resistencia a piretroides en ácaros depredadores

Résumé

Los piretroides constituyen un grupo de plaguicidas catalogados como moduladores del canal de sodio (Grupo 3), según el comité de acción contra la resistencia a los insecticidas (IRAC). Estos plaguicidas son análogos sintéticos de las piretrinas, compuestos naturales con actividad insecticida que se encuentran en las flores de las plantas del género Chrysanthemum, popularmente conocidas como crisantemos. Actualmente, existen numerosos productos plaguicidas que contienen en su formulación piretroides, siendo ampliamente utilizados en el control de plagas en diferentes contextos como la agricultura, la ganadería, la apicultura e incluso a nivel doméstico, erigiéndose como uno de los grupos de plaguicidas con mayor cuota de mercado. Tanto las piretrinas, como los piretroides se unen al canal de sodio dependiente de voltaje (VGSC por sus siglas en inglés). Esta proteína, que se encuentra presente en las membranas de las neuronas, tiene un papel clave en la transmisión del impulso nervioso a través de los axones. La unión de los piretroides a la proteína provoca su mal funcionamiento. Concretamente, cuando la membrana se despolariza al inicio de un potencial de acción, el canal se abre permitiendo la entrada de iones sodio (Na+) al interior de la neurona, llevando el potencial de membrana a valores más positivos. Esta acción ocurre de una manera muy rápida, ya que el canal rápidamente se cierra deteniendo la entrada de iones. Los piretroides se unen dificultando esta transición entre el estado abierto y cerrado, causando un mal funcionamiento del sistema nervioso y en última instancia, la muerte. El VGSC es una proteína de membrana formada por cuatro dominios, que presentan una alta homología entre ellos, unidos por loops intracelulares. A su vez, cada dominio está compuesto por 6 segmentos transmembrana. Esta proteína forma un poro en la membrana con permeabilidad selectiva a cationes de sodio. Debido a su importante función en la transmisión del impulso nervioso, el gen que la codifica está muy conservado en los metazoos. A diferencia de los vertebrados, los artrópodos solo presentan una copia del gen, aumentando la conservación de este gen entre las especies dentro del clado debido a la fuerte presión de selección que sufre el canal. Las denominadas como mutaciones de tipo kdr (del inglés knock down resistance) o super-kdr corresponden a mutaciones en la secuencia del VGSC asociadas a fenotipos de resistencia a piretroides. Estas mutaciones se localizan principalmente en dos regiones muy concretas del canal de sodio, que se corresponderían con los sitios de unión de los piretroides. Estudios recientes utilizando modelos predictivos de la estructura del canal han confirmado la existencia de los dos sitios de unión, analizando como las mutaciones en los residuos que conforman estos sitios dificultarían la unión de los piretroides, provocando fenotipos de resistencia. El sitio de unión de piretroides 1 (PyR1) estaría constituido por el linker IIS4-5, el IIS5 y el IIIS6. El sitio de unión 2 (PyR2) estaría formado por el linker IS4-5, el IS5, IS6 y IIS6. Existen mutaciones asociadas con la resistencia que están alejadas de estos sitios. En esos casos se plantea que estas ejercerían su efecto de manera alostérica. El uso intensivo de los plaguicidas ha provocado la aparición de poblaciones resistentes en todo el mundo. En el caso concreto de los piretroides, se han descrito dos mecanismos principales de resistencia; la modificación del sitio de unión y la resistencia metabólica. La modificación del sitio de unión consiste en la mutación de los residuos clave para la interacción entre el VGSC y el piretroide. Por otro lado, la resistencia metabólica consiste en el aumento de la capacidad de degradar los piretroides, y suele involucrar a las principales familias de enzimas de detoxificación, monooxigenasas citocromo P450 (P450s), glutatión S-transferasas (GSTs) y carboxilesterasas (CEs). Los agentes de control biológico (ACBs) engloban a diferentes especies utilizadas para el control de plagas. Un grupo destacado dentro de estos ACBs son los ácaros depredadores, muchos de ellos pertenecientes a la familia Phytoseiidae. De entre los diferentes enfoques que se pueden adoptar para combatir las plagas, en las últimas décadas ha destacado la Gestión Integrada de Plagas (GIP). La GIP consiste en un enfoque holístico que combina diferentes prácticas y técnicas que tienen como finalidad controlar las plagas reduciendo el uso de fitosanitarios a niveles económica y ecológicamente justificables. Los ACBs son una de las principales herramientas que posee la GIP para el control de plagas. Estos artrópodos también poseen la capacidad de desarrollar resistencia a diferentes plaguicidas. De hecho, contar con ACBs que posean la capacidad de resistir los tratamientos fitosanitarios utilizados en los cultivos constituye un rasgo muy deseable. Esto habilitaría la combinación de estos ACBs con el uso de plaguicidas en los escenarios que lo requiriesen. El objetivo principal de este trabajo fue dilucidar los mecanismos de resistencia a los piretroides en varias especies de ácaros depredadores, realizando una caracterización toxicológica y molecular de la respuesta a la deltametrina en varias poblaciones. Además, también se ha optimizado un sistema de edición genómica como herramienta para el estudio del efecto de mutaciones asociadas con la resistencia a plaguicidas en poblaciones de artrópodos de interés económico. Los ácaros depredadores representan los ACBs más utilizados en control biológico, siendo especies muy relevantes para el estudio de la resistencia a plaguicidas. En el capítulo 1 de nuestro trabajo hemos analizado el efecto de la deltametrina sobre varias poblaciones de las especies Phytoseiulus persimilis, Amblyseius swirskii y Neoseiulus californicus, tres de los ácaros más utilizados como ACBs. Todas las poblaciones de P. persimilis analizadas en este trabajo han mostrado mutaciones del tipo kdr y super-kdr en el gen del VGSC. Las poblaciones caracterizadas toxicológicamente, suministradas por las empresas Koppert Biological Systems (en adelante, Koppert) y Syngenta Bioline (en adelante, Syngenta) han mostrado diferentes niveles de resistencia a los tratamientos con deltametrina. La población de Koppert ha sido la población que ha mostrado un nivel de resistencia mayor. En ambas poblaciones se separaron los ácaros vivos y muertos tras los tratamientos con diferentes concentraciones de deltametrina y se analizó la secuencia del VGSC. Concretamente, en la población de Syngenta, los ácaros que sobrevivieron al tratamiento con deltametrina a 10 ppm eran homocigotos para las mutaciones M918L y A1536T. Por otra parte, los ácaros que no sobrevivían mostraban las mutaciones M918L, L925V y A1536T, pero en este caso eran heterocigotos con los residuos canónicos. En la población de Koppert, todos los ácaros eran homocigotos para la mutación M918L y aquellos que sobrevivían al tratamiento con deltametrina a 40 ppm tenían también la mutación L925V en homocigosis. Los ácaros susceptibles eran también homocigotos para la mutación M918L, pero exhibían la leucina canónica en la posición 925. Un dato curioso, que contrasta con lo encontrado en los ácaros que sobrevivían al tratamiento, es que los ácaros susceptibles tenían la mutación T1539S también en homocigosis. En esta población se realizó un análisis del genotipo de ácaros individuales y se encontró ligamiento entre los alelos L925 y S1539 y entre los alelos V925 y T1539. En A. swirskii, se analizaron dos poblaciones, una procedente de campo y otra suministrada por Koppert. El análisis preliminar de las secuencias del gen del VGSC mostró que ambas poblaciones presentaban mutaciones de resistencia. La población comercial tenía la mutación L925V fijada, sin rastro del alelo WT y la población de campo las mutaciones M918L y L925V junto con los alelos WT. Los resultados de los bioensayos con deltametrina revelaron que ambas poblaciones serían capaces de sobrevivir a concentraciones superiores a las que se usan habitualmente en el campo. La población de Koppert mostró un nivel de resistencia mayor. En esta población la separación de ácaros entre vivos y muertos no mostró diferencias genéticas en la región de interés del VGSC. En cambio, la población de campo mostró una variabilidad mayor. Aquellos ácaros que no resistían el tratamiento con deltametrina a 40 ppm poseían únicamente los alelos M918 y L925. Por otra parte, el resto de los ácaros analizados, supervivientes a los tratamientos con deltametrina 40 ppm, deltametrina 60 ppm y ácaros muertos en el tratamiento de 60 ppm poseían las mutaciones M918L y L925V junto con los alelos WT. Los resultados de los bioensayos, juntamente con el perfil genético, sugerían que había otros mecanismos de resistencia diferentes a la modificación del sitio de unión contribuyendo al fenotipo resistente en estas poblaciones. Entonces, se analizó el efecto de un tratamiento con deltametrina a 20 ppm sobre ácaros que habían sido tratados previamente con compuestos que inhiben los principales grupos de enzimas de detoxificación. Estos ensayos mostraron un aumento significativo de la mortalidad cuando se pretrató a los ácaros con el sinergista BOP, inhibidor de las monooxigenasas citocromo P450. La mortalidad fue de sólo un 3,4% en el tratamiento con deltametrina a 20 ppm, mientras que el tratamiento combinado (BOP + deltametrina 20 ppm) provocó un aumento significativo de la mortalidad hasta el 18,4%. Estos datos indicaron que, en esta población, el fenotipo resistente se debía en parte a la contribución de la resistencia metabólica. Complementariamente, en la población de Koppert se realizaron ensayos de semi-campo, aplicando varios tratamientos con deltametrina sobre plantas de pimiento colonizadas con los ácaros, el fin de estos ensayos era comprobar si los resultados obtenidos en bioensayos de laboratorio eran representativos de los resultados en un entorno más similar al campo (semi-campo). Estos ensayos mostraron una reducción drástica en el número de ácaros por planta después de los tratamientos con deltametrina en un contraste claro con los resultados obtenidos en los bioensayos de laboratorio. Para profundizar en el efecto de la deltametrina sobre los ácaros se realizaron otros ensayos complementarios. En primer lugar, no se detectó un efecto de repelencia por parte de los volátiles emitidos por las plantas tratadas con deltametrina, tampoco se observó un aumento de la mortalidad debida al contacto prolongado de los ácaros con la superficie contaminada con el plaguicida. En los ensayos de elección, no hubo diferencias significativas entre el número de ácaros que permanecían en la superficie tratada frente a aquellos que se quedaron sobre la superficie no tratada. Sin embargo, sí se encontró un aumento significativo en los ácaros que escapan del disco de hoja. Este resultado sugiere un posible efecto de repelencia y/o irritabilidad provocada por las superficies tratadas con deltametrina. También se pudo demostrar que los ácaros escapaban activamente de las plantas tratadas, a diferencia de lo que ocurría en los controles no tratados. Los ácaros huían de las plantas tratadas, encontrándose un mayor número en las trampas ubicadas en los tallos de las plantas con el tratamiento de deltametrina. En N. californicus se analizó la población procedente de Koppert. La caracterización toxicológica del ácaro mostró una mortalidad reducida en los tratamientos con deltametrina, siendo capaz de resistir tratamientos superiores a las dosis de campo. El análisis del gen del VGSC no mostró mutaciones del tipo kdr o super-kdr, tampoco se encontraron diferencias en las regiones analizadas del VGSC en los ácaros muertos y los vivos después de los tratamientos. Los bioensayos utilizando compuestos sinergistas mostraron un aumento de la mortalidad cuando se pretrató a los ácaros con IBP. La mortalidad al tratar con deltametrina a 20 ppm fue del 19,1% y la mortalidad del tratamiento combinado con IBP + deltametrina 20 ppm fue del 75,4%. Los sinergistas BOP y DEM no provocaron un aumento de la mortalidad del tratamiento con deltametrina 20 ppm. Complementariamente, con el fin de analizar la secuencia completa del canal, se secuenció y ensambló el transcrito del VGSC. La comparación de la secuencia con las bases de datos mostró una gran homología con especies emparentadas como Galendromus occidentalis. En todas las especies analizadas al menos una población ha mostrado la capacidad de resistir tratamientos con deltametrina a concentraciones superiores a las dosis de campo. Estos resultados contrastan con la información ofrecida por las empresas proveedoras de estos ACBs, además los resultados resultan útiles para el diseño de estrategias de GIP más robustas y eficaces. En el capítulo 2 de este trabajo se optimizó un sistema para la edición genómica de Spodoptera exigua, vía CRISPR/Cas9, que permitiese la introducción de mutaciones en el gen del VGSC. Las primeras etapas se focalizaron en aumentar la viabilidad del huevo tras la microinyección optimizando parámetros como la cantidad de contraste utilizada para la visualización de los huevos, las condiciones de incubación de los huevos, el tratamiento de desinfección previo a la microinyección y las características de las agujas capilares utilizadas. Los resultados mostraron que la adición de Rojo de fenol a una concentración de 0,01% era suficiente para discriminar los huevos microinyectados. Además, se determinó que era necesario mantener un nivel adecuado de humedad relativa y protección contra los hongos para garantizar la viabilidad de los huevos. En el caso de los capilares se determinó que había dos configuraciones óptimas para nuestro trabajo. Una para los capilares utilizados en los dispositivos mecánicos y otra para los dispositivos neumáticos. Una vez optimizado el proceso de microinyección e incubación de los huevos, se procedió a la optimización de la edición genómica. El primer gen escogido para la edición genómica fue el gen abd-A, un gen homeótico con un papel clave en el desarrollo larvario. La disrupción de este gen provoca un entrecruzamiento de los segmentos que componen la larva, fenotipo muy fácil de apreciar. Estas características lo convierten en un candidato óptimo, cuando se quiere llevar a cabo una optimización de la edición genómica, ya que el fenotipo producido es fácilmente identificable. Se llegó a alcanzar una ratio de eclosión del 31,25% después de la optimización. En total eclosionaron 82 larvas, de las cuales 10 mostraron el fenotipo de disrupción del gen abd-A. Una vez demostrado que se podían obtener mutantes del tipo knock out se procedió a la obtención de mutantes knock in en el receptor de rianodina (RyR) y en el VGSC. En el caso del RyR se pretendía la introducción de la mutación G4946E, conocida por causar resistencia a las diamidas. Eclosionaron 27 larvas de un total de 2616 huevos microinyectados, obteniendo una ratio de eclosión del 1,1%. Las larvas eclosionadas fueron genotipadas y una de ellas mostró haber introducido la mutación G4946E en heterocigosis además del SNP para evitar el reconocimiento por el crRNA. En cuanto al gen del VGSC de S. exigua, su edición fue la más difícil de acometer. El objetivo era la introducción de la mutación M918T y para ello se probaron diferentes concentraciones de los componentes CRISPR/Cas9 y se diseñaron diferentes crRNAs y ssODN. También se probó con diferentes dispositivos de microinyección. Los resultados muestran un mejor desempeño de los dispositivos neumáticos frente a los dispositivos mecánicos, siendo el mejor resultado el obtenido con el FemtoJet con un 3,05% de ratio de eclosión. Además, utilizando los dispositivos neumáticos junto con el ssODN Se-e18-superKDR se consiguió alcanzar un éxito notorio en la introducción de la mutación, al conseguir un porcentaje de mutación del 87,8% y 187 larvas que mostraron el genotipo mutante. Estos resultados se obtuvieron utilizando análisis RFLP ya que el ssODN Se-e18-superKDR introducía una diana de restricción TaqI. Estas larvas se dejaron desarrollar hasta adultos, pero no se logró obtener descendencia que portase la mutación, no pudiendo caracterizar el efecto de la mutación de manera aislada. También se encontró que las mutaciones del tipo indel no impiden el desarrollo de la larva en el huevo, pero si resultan letales, posiblemente por las características y función del VGSC.