Caracterización de la resistencia de cronobacter sakazakii al calor y a diferentes tecnologías emergentes de conservación de los alimentos

Resumen

La inocuidad de los alimentos que diariamente consumimos es condición fundamental para garantizar la seguridad alimentaria. Por ello, los alimentos deben estar libres de aquellos agentes capaces de comprometer la salud de los consumidores. En la actualidad, los microorganismos (bacterias, virus y protozoos, fundamentalmente) son los mayores peligros asociados a los productos alimentarios, pues muchos de ellos son agentes causales de enfermedades. Cronobacter sakazakii es una bacteria Gram-negativa perteneciente a la familia Enterobacteriaceae que en los últimos años ha despertado gran interés y preocupación entre las agencias reguladoras, los profesionales de la salud, la comunidad científica y la industria alimentaria, por su impacto en la salud humana. Esta especie es responsable de numerosos casos de meningitis, bacteriemia y enterocolitis necrótica neonatal, llegando a ser fatal en algunos de ellos, y ha causado también infecciones en niños y adultos inmunodeprimidos. A pesar de que por el momento el único alimento implicado epidemiológicamente y microbiológicamente en casos de infección y muerte neonatal es la leche en polvo destinada a la alimentación artificial de los recién nacidos, C. sakazakii se halla ampliamente distribuido en la naturaleza. Se cree que el agua, el suelo y los productos vegetales son su reservorio natural, habiéndose aislado incluso en agua considerada apta para el consumo, en bebidas y en una amplia variedad de alimentos e ingredientes alimentarios, tanto de origen animal como vegetal, y tanto crudos como procesados. Por ello, en la actualidad se cree que estos productos también podrían ser, en determinadas circunstancias, vías de contaminación, colonización e infección para la población inmunodeprimida. En las últimas décadas la Tecnología de los Alimentos se encuentra desarrollando nuevas tecnologías de inactivación microbiana, alternativas al calor, que genéricamente se engloban bajo el nombre de Tecnologías Emergentes de Conservación de Alimentos. Con ellas se pretende dar solución a las dificultades planteadas por los procesos productivos de pasteurización y esterilización térmica de los alimentos. Se espera que estas ¿nuevas tecnologías¿ permitan satisfacer las necesidades del consumidor actual que demanda productos, además de seguros, mucho más variados y con mayor calidad, en un sentido amplio del término. Además, la aplicación de estas nuevas tecnologías seguramente abrirá un amplio abanico de posibilidades en la industria agroalimentaria que se enfrenta a una alta competitividad debido a la globalización y diversificación de mercados. La implantación de una nueva tecnología de conservación de alimentos exige conocer los riesgos alimentarios que puede conllevar su aplicación, en otras palabras, saber si el proceso es capaz de inactivar hasta los niveles de seguridad requeridos a los microorganismos patógenos de transmisión alimentaria que pudieran ser vehiculados por el producto. A este respecto, es necesario destacar que las especies limitantes de los tratamientos pueden variar con la tecnología elegida. En el momento de iniciar esta Tesis Doctoral apenas existían datos en la bibliografía sobre la resistencia de C. sakazakii frente a estas nuevas tecnologías de conservación que permitieran establecer si en algún caso esta especie podría representar un riesgo para la Salud Pública. Esta Tesis Doctoral se planteó con el fin de cubrir esta laguna del conocimiento, realizando una caracterización de la resistencia de C. sakazakii frente al calor (como tecnología de referencia), y cuatro tecnologías no térmicas de conservación: los pulsos eléctricos de alto voltaje (PEAV), las altas presiones hidrostáticas (APH), los ultrasonidos (US) y la radiación ultravioleta de onda corta (UV-C). El objetivo último del trabajo fue establecer bajo qué condiciones podría realmente esta especie representar una mayor amenaza para la seguridad alimentaria de aplicarse alguna de estas nuevas tecnologías de conservación. Para alcanzar este objetivo general se definieron las siguientes actividades concretas: - Establecer las cinéticas de inactivación para cada una de las tecnologías de estudio, eligiendo el modelo matemático más adecuado para su descripción y la obtención de los parámetros de resistencia. - Evaluar la influencia de diversos factores genéticos, medioambientales y de procesado en la resistencia de esta especie a cada una de las tecnologías. - Evaluar la aparición de daños subletales tras los tratamientos, considerándolos como un indicador adicional de la resistencia intrínseca de este microorganismo a las distintas tecnologías y su posible implicación en los mecanismos de inactivación. - Explorar condiciones de tratamiento apropiadas para el desarrollo de procesos combinados que permitan alcanzar mayores niveles de inactivación, bien por el aprovechamiento de los daños subletales generados por las tecnologías o bien por la combinación inteligente de las mismas. Los resultados obtenidos en esta investigación se recogen en nueve manuscritos, que se presentan en el apartado de Resultados. En los Manuscritos I, II, IV, VII y VIII se estudia la resistencia de C. sakazakii a las cinco tecnologías evaluadas en esta investigación: el calor, los PEAV, los US, las APH y la radiación UV-C, respectivamente, siguiéndose en todos ellos un plan de trabajo similar. En los restantes Manuscritos (III, V, VI y IX), se profundiza en algunos aspectos de estas tecnologías que, por resultar ser de especial interés, se han estudiado de forma independiente. Para dar una visión más global, y a su vez complementaria a la que proporcionan los manuscritos, la sección de Discusión se ha enfocado de forma diferente. La Discusión se estructura en tres capítulos en los que se realiza un análisis exhaustivo y comparativo de todas las tecnologías, correlacionando los resultados entre sí y dándoles una perspectiva transversal, que es difícil de deducir de la simple lectura de los manuscritos. En el capítulo uno, las cinéticas de inactivación frente a cada tecnología se evalúan y comparan, así como los efectos de los factores genéticos, medioambientales y de procesado en la resistencia de C. sakazakii a cada una de ellas. Asimismo, se evalúa la aparición de daños subletales en las envolturas celulares de C. sakazakii tras los tratamientos en diversas condiciones experimentales, como indicador de la resistencia intrínseca de esta especie y su posible implicación en los mecanismos de inactivación. Los resultados más relevantes de este capítulo se citan a continuación. 1. Por lo que respecta a las cinéticas de inactivación, los resultados obtenidos demuestran que las gráficas de supervivencia de C. sakazakii frente a cada una de las tecnologías presentan perfiles de inactivación distintos. La mayoría de los perfiles obtenidos son similares a los descritos para otros microorganismos bajo similares condiciones experimentales; pero además, se describen por primera vez gráficas con un perfil convexo frente a los PEAV (aquellas obtenidas en medios de reducida aw), y gráficas frente al calor que evolucionan desde la linealidad hasta la convexidad, pasando por un perfil sigmoideo, dependiendo del tiempo de cultivo de las células. Los perfiles de las gráficas de supervivencia observados en esta investigación se han descrito mediante modelos matemáticos sencillos y ampliamente utilizados en microbiología predictiva. Asimismo, los parámetros de resistencia calculados con estos modelos nos permiten realizar comparaciones cuantitativas entre los resultados obtenidos en diferentes condiciones experimentales, así como calcular la intensidad de los tratamientos necesarios para garantizar un determinado nivel de inactivación. 2. La magnitud de la influencia de los diferentes factores genéticos y medioambientales depende de la tecnología investigada. Así, mientras la resistencia de C. sakazakii al calor y las APH es notablemente dependiente de la mayoría de los factores ensayados, éstos apenas modifican la resistencia de este microorganismo frente a los US y los UV-C. 3. El estudio de la variabilidad intraespecífica en la resistencia de esta especie a las diferentes tecnologías revela que frente al calor y las APH existe una notable variación en resistencia debida a la cepa, mientras dicha variación es mucho menor en el caso de los PEAV, y apenas existente en el caso de los US y UV-C. Por otro lado, mientras la entrada en fase estacionaria de crecimiento supone siempre un aumento de la resistencia de C. sakazakii frente a todas las tecnologías, una incubación prolongada en fase estacionaria solamente supone un aumento de la resistencia, así como un cambio en el perfil de las gráficas de supervivencia frente al calor. Por su parte, la temperatura de crecimiento ejerce una influencia más marcada en la resistencia al calor y a las APH que frente al resto de tecnologías, pero en cualquier caso de una magnitud siempre inferior a la proporcionada por otros factores. 4. La preexposición de las células de C. sakazakii a diferentes choques subletales revela que las únicas combinaciones de choque subletal y agente letal que conducen a un incremento significativo de la resistencia son: calor-calor, calor-PEAV y medio ácido-PEAV. No obstante, en nuestras condiciones experimentales, estos incrementos son de pequeña magnitud. 5. Por lo que respecta al efecto de las condiciones físico-químicas del medio de tratamiento, los resultados indican que: el pH no modifica la eficacia letal de los US ni de la radiación UV-C, aumenta notablemente la eficacia letal del calor y las APH, y disminuye marcadamente la de los PEAV. La disminución de la aw del medio de tratamiento aumenta la resistencia de C. sakazakii frente a todas las tecnologías, salvo frente a la radiación con UV-C. Por último, el estudio de la resistencia de C. sakazakii en distintos alimentos pone de manifiesto que la leche ejerce un efecto protector frente a todas las tecnologías, mientras que, por ejemplo, el zumo de manzana protege frente al calor y sensibiliza frente a las APH. En el caso concreto de los UV-C, la importancia de la composición del medio de tratamiento parece depender únicamente de su coeficiente de absorción. 6. Los principales parámetros de procesado: la temperatura en los tratamientos térmicos, el campo eléctrico en los PEAV, la presión en las APH, la energía transferida al medio en los US y la dosis de radiación en los UV-C, ejercen en C. sakazakii una influencia similar a la descrita en la bibliografía para otros microorganismos. 7. Tanto el calor como las APH conducen a la aparición de células subletalmente dañadas, tanto en sus membranas externas como internas, en la población de supervivientes en todas las condiciones estudiadas. En el caso de los PEAV, la aparición de células subletalmente dañadas en sus membranas depende de las condiciones de tratamiento, apareciendo daños a pH 4,0 pero no a 7,0, y tan solo en la membrana externa en medios de baja aw. Los tratamientos de US tan solo producen daños subletales en la membrana externa de C. sakazakii y los de UV-C no producen daños subletales en ninguna de las dos envolturas en ninguna de las condiciones estudiadas. En el capítulo dos, la resistencia C. sakazakii se compara con la de otras especies patógenas y alterantes de los alimentos frente a cada una de las tecnologías investigadas. Siempre que ha sido posible se han utilizado para la comparación datos obtenidos en idénticas condiciones experimentales. En el caso de las APH, donde esto no fue posible, las comparaciones se realizaron con datos obtenidos por otros grupos de investigación en equipos semejantes al utilizado en esta investigación. Del capítulo puede concluirse que las circunstancias en las que C. sakazakii puede suponer un riesgo, dada su notable resistencia, son: frente a tratamientos térmicos en medios de reducida aw y frente a tratamientos por PEAV especialmente en medios de pH ácido y/o reducida aw. También podría constituir un riesgo en el caso de los tratamientos por UV-C ya que, aunque las diferencias interespecíficas son pequeñas, se encuentra siempre entre las especies más resistentes. No existen datos suficientes para la comparación por lo que no ha podido concluirse si podría suponer un riesgo en alimentos o medios de baja aw tratados por APH. En el capítulo tres, se exploran condiciones de tratamiento apropiadas para el desarrollo de procesos combinados que permitan alcanzar los niveles de inactivación de C. sakazakii deseados con tratamientos de menor intensidad, bien aprovechando los daños subletales generados por las nuevas tecnologías, o bien mediante su combinación con el calor. Los resultados más relevantes de este capítulo se podrían resumir en: 1. La aparición de células de C. sakazakii subletalmente dañadas en su membrana externa por los tratamientos PEAV en medio ácido permiten aumentar significativamente (efecto sinérgico) la letalidad de tales tratamientos mediante la adición de algunos compuestos antimicrobiano, como el citral. Esta combinación podría contribuir a solucionar el problema que plantea la elevada resistencia de C. sakazakii a los PEAV en medios de pH ácido. 2. La eficacia letal de la combinación calor + ultrasonidos bajo presión (manotermosonicación, MTS) es el resultado de un efecto sinérgico, tanto en tampones de diferente pH y aw, como en alimentos. Asimismo, el incremento de la temperatura de tratamiento supone un incremento significativo y sinérgico de la letalidad de la radiación UV-C sobre las células de C. sakazakii. Ambas combinaciones, además de aumentar sinérgicamente la letalidad de los tratamientos, también suponen un abaratamiento de los costes de producción. En definitiva, los resultados obtenidos en esta investigación contribuyen al conocimiento de la resistencia, y por tanto a las posibilidades de supervivencia, de C. sakazakii frente a las principales nuevas tecnologías de conservación de los alimentos. También contribuyen al conocimiento de cuáles son o podrían ser los factores limitantes para cada una de ellas, lo que constituye una herramienta útil para el adecuado diseño u optimización de procesos industriales con el claro objetivo de garantizar la inocuidad de los alimentos.