Implicación de las envolturas celulares en el mecanismo de inactivación microbiana mediante tecnologías emergentes de conservacióndesarrollo de procesos combinados

Resumen

I. INTRODUCCIÓN: En la actualidad los consumidores demandan alimentos de gran calidad, seguros desde un punto de vista sanitario, mínimamente procesados y que además sean sanos. Durante los últimos años se ha realizado un enorme esfuerzo investigador con objeto de desarrollar métodos no térmicos de conservación de los alimentos. De entre los métodos no térmicos propuestos, los Pulsos Eléctricos de Alto Voltaje (PEAV) y las Altas Presiones Hidrostáticas (APH) han atraído mucho interés, ya que son capaces de inactivar los microorganismos sin causar alteraciones indeseables en las propiedades sensoriales y nutricionales de los alimentos. La capacidad de estas tecnologías no térmicas de conservación para inactivar microorganismos ha sido ampliamente demostrada. Sin embargo, algunos estudios han mostrado la elevada resistencia que presentan algunos microorganismos como Listeria monocytogenes y Escherichia coli O157:H7 a estas técnicas de conservación en medios de laboratorio y en alimentos, tales como leche y zumos, lo que podría limitar el uso de estas técnicas en la conservación de los alimentos. Por este motivo, actualmente, se está trabajando en el desarrollo de procesos más complejos que, combinando diversas tecnologías, permitan lograr mayor estabilidad y seguridad de los productos sin detrimento de su calidad. La conservación de los alimentos por procesos combinados consiste en el uso de varios métodos de conservación aplicados de forma simultánea y/o sucesiva con objeto de mejorar el efecto letal conseguido por cada una de las tecnologías por separado. La conservación de los alimentos por procesos combinados o tecnología de las barreras, en realidad se ha utilizado desde tiempos remotos, pero el desarrollo de nuevos métodos de inactivación representa nuevas posibilidades de utilización que hacen necesario su estudio. Para establecer una combinación inteligente de diversos métodos de conservación es necesario conocer con exactitud su mecanismo de inactivación, lo que será de enorme utilidad en la elección de las condiciones de tratamiento más adecuadas. De esta manera, mediante la aplicación de tratamientos combinados que resultaran favorables se podría reducir la intensidad de aplicación y/o incrementar el efecto letal conseguido. En este sentido, la existencia de daño subletal en las envolturas celulares de los microorganismos puede presentar gran importancia en la conservación de los alimentos por procesos combinados. Puesto que las células microbianas dañadas pueden presentar una menor resistencia a las condiciones ambientales adversas, desde un punto de vista práctico, la detección de daño subletal, su cuantificación y la realización de estudios acerca de su reparación, pueden ser de gran relevancia en el desarrollo de procesos combinados. El porcentaje de células dañadas tras un determinado tratamiento de conservación puede ascender a la gran mayoría de la población superviviente. Así, una combinación apropiada de estrategias de conservación, podría evitar la reparación de las células dañadas, y además, aprovechar la existencia de daños para facilitar la acción antimicrobiana de los diferentes agentes, lo que podría conducir a la obtención de efecto letal sinérgico y el incremento del nivel de inactivación final. Por otra parte, la existencia de células subletalmente dañadas puede ser un hecho decisivo desde el punto de vista de la seguridad alimentaria, ya que un pequeño porcentaje de células capaces de reparar sus daños tras los tratamientos de conservación puede alcanzar concentraciones infectivas. El mecanismo de inactivación por PEAV está íntimamente relacionado con la formación de poros en la membrana citoplasmática, y a su vez, también se encuentra influenciado de alguna manera por la presencia de la pared celular bacteriana. Además, se ha demostrado la existencia de daño subletal en la membrana citoplasmática bacteriana tras tratamientos de PEAV. En el caso de las APH, el mecanismo de inactivación microbiana es más complejo, pero la aparición de daños en las envolturas celulares también parece ser un factor fundamental. Además, también se ha demostrado la existencia de daños subletales en las envolturas celulares bacterianas tras tratamientos de presurización. En ambos casos y dependiendo de la intensidad de tratamiento, se ha demostrado la formación de poros reversibles e irreversibles en las envolturas celulares. Pero, mientras que la permeabilización irreversible conduce a la muerte celular, los poros reversibles se pueden reparar permitiendo que la célula recupere su estado fisiológico nativo. La existencia de daño subletal en las envolturas celulares, y/o de poros reversibles, podría ser de gran utilidad en el diseño de procesos de conservación de los alimentos basados en la combinación de estas tecnologías con otros conservantes o agentes antimicrobianos naturales. En ocasiones, los agentes antimicrobianos no resultan efectivos debido a la impermeabilidad natural que presentan las envolturas celulares. Así, los daños temporales en estas estructuras celulares podrían facilitar la acción de los agentes antimicrobianos incrementando el efecto letal observado incluso a dosis moderadas. La búsqueda de agentes antimicrobianos naturales que resulten inocuos ha sido otro de los principales temas de investigación en ciencia de los alimentos en los últimos años. En este aspecto, de entre la gran variedad existente de agentes con capacidad antimicrobiana, los aceites esenciales han atraído el interés de diversos grupos de investigación. El citral es un monoterpeno insaturado acíclico que se puede encontrar de forma natural en el aceite esencial de diversas frutas cítricas, diferentes hierbas y especias aromáticas. Debido a su potente aroma a limón se utiliza frecuentemente para aportar aroma a las bebidas y otros productos. Se ha demostrado que el citral presenta acción antimicrobiana sobre diversos microorganismos patógenos, sin embargo, los principales factores que afectan a la resistencia microbiana del citral y las bases biológicas que la sustentan, así como su mecanismo último de acción, no se conocen con exactitud. Se sabe que, en general, la membrana plasmática es la principal estructura diana de la acción tóxica de los terpenos, sin embargo, el mecanismo último por el cual estas sustancias causan inhibición del crecimiento, daño celular e inactivación, no esta totalmente definido. II. OBJETIVOS: Teniendo en cuenta estos antecedentes, el objetivo general de esta Tesis Doctoral fue profundizar en el estudio de la implicación de las envolturas celulares en el mecanismo de inactivación microbiana por las tecnologías emergentes de conservación, con objeto de establecer las condiciones más ventajosas para el desarrollo de procesos combinados. Para alcanzar este objetivo general, la investigación se ha dividido en dos apartados principales: 1.-Profundizar en la implicación de las envolturas celulares en el mecanismo de inactivación microbiana por PEAV, APH y diferentes agentes antimicrobianos, que comprende el estudio de: ¿ La resistencia de diversas especies microbianas. ¿ La presencia de daños subletales en las envolturas celulares bajo distintas condiciones de tratamiento. ¿ La influencia de diversos factores del procesado, microbianos y del medio de tratamiento en la resistencia microbiana y magnitud del daño subletal. ¿ Los mecanismos implicados en la reparación de las células dañadas subletalmente. 2.-Desarrollar de forma preliminar procesos combinados de conservación que permitan alcanzar mayores niveles de inactivación microbiana, logrando de esta manera la estabilidad, seguridad y máxima calidad de los alimentos demandada hoy en día por los consumidores. III. MATERIAL Y MÉTODOS: Puesto que las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, así como las levaduras, son importantes microorganismos en el ámbito de la conservación de los alimentos y presentan diferencias en sus envolturas celulares, estos tres grupos microbianos fueron objeto de estudio en esta Tesis Doctoral. Por lo tanto, los microorganismos estudiados en esta investigación fueron Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae y Dekkera bruxellensis. Los tratamientos de PEAV se aplicaron en dos equipos diferentes, uno de ellos capaz de aplicar pulsos de caída exponencial, y el otro capaz de generar pulsos de onda cuadrada con una anchura de 3 µs. Para evitar los efectos ocasionados por el calor, en todos los casos, la temperatura de las muestras tras los tratamientos de PEAV fue inferior a 35ºC. Los tratamientos de APH se aplicaron en un equipo que contaba con un vaso de presurización de 300 ml. En todos los casos, la máxima temperatura que alcanzaron las muestras durante el tratamiento de presurización fue de 28ºC. En cuanto a los agentes antimicrobianos, se evaluó el efecto conservador del citral, la tert-butil hidroquinona (TBHQ) y el ácido sórbico. Por otro lado, para determinar el efecto letal de los procesos combinados, se aplicaron tratamientos de calor, PEAV y APH en presencia de los diferentes agentes antimicrobianos antes mencionados. Para evaluar la influencia ejercida por factores de diferente naturaleza en la resistencia microbiana y la aparición de daño subletal, los tratamientos fueron aplicados a diferente intensidad, y utilizando una amplia variedad de medios de tratamiento y células microbianas en diferentes condiciones fisiológicas. Con objeto de determinar las células dañadas subletalmente tras los tratamientos, se evaluó el número de supervivientes tanto en un medio no selectivo, como en un medio selectivo. La utilización de cloruro sódico como agente selectivo permite detectar alteraciones en la integridad y/o funcionalidad de la membrana citoplasmática, mientras que la adición de sales biliares al medio de recuperación permite detectar los daños ocasionados en la membrana externa. El número de células subletalmente dañadas se estimó por la diferencia en el número de UFC observado tras utilizar un medio de recuperación no selectivo y otro selectivo. Por otra parte, el mecanismo de reparación de las células microbianas subletalmente dañadas se evaluó inoculando las células en diferentes medios líquidos de reparación a los que se habían adicionado inhibidores específicos para los procesos metabólicos de reparación celular. Además, para evaluar la permeabilización celular se utilizó la técnica de tinción con el fluorocromo yoduro de propidio (YP). IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN: Los resultados obtenidos en esta investigación indicaron que existía una gran variabilidad intraespecífica en la resistencia de E. coli a los PEAV. Además, el estudio del comportamiento de la cepa parental E. coli BJ4 y su mutante nulo en el gen rpoS, E. coli BJ4L1, mostró que la expresión del factor ¿S era responsable en gran parte de la reparación de los daños ocasionados por los tratamientos de PEAV en las envolturas celulares de E. coli. Sin embargo, el estudio de la cepa parental L. monocytogenes EGD-e y su mutante EGD-e ¿sigB, indicó que el factor sigma alternativo ¿B no afectaba a la resistencia de L. monocytogenes a los PEAV. Por otro lado, la exposición a temperaturas subletales previa a los tratamientos de PEAV no afectó a la supervivencia de E. coli, pero sí que incrementó la capacidad de reparación de las células de L. monocytogenes. El estudio de los mecanismos de reparación de los daños subletales ocasionados en las envolturas celulares puede contribuir en la descripción de las estructuras celulares afectadas por los tratamientos de PEAV y el tipo de daños ocasionados, así como a un conocimiento más profundo de las rutas metabólicas que intervienen en el proceso de reparación. La evaluación de la reparación de las células de L. monocytogenes dañadas subletalmente demostró que existía un pequeño porcentaje de células que eran capaces de reparar sus daños, aparentemente sin requerimiento metabólico alguno, mientras que la mayoría de las células requerían la síntesis de energía para hacerlo. La energía es un requerimiento metabólico que no indica ningún tipo de daño específico, y que se precisa para la reparación de los daños celulares causados por otros tratamientos como la congelación, el desecado, la acidificación, las APH o los PEAV. Al contrario de los resultados observados en la reparación de las células de E. coli dañadas por PEAV, L. monocytogenes no precisó de la síntesis de lípidos para su reparación, lo que podría indicar que existe una mayor protección celular o que los daños ocasionados en L. monocytogenes son de menor severidad, lo que se podría explicar por la gruesa capa de peptiglicano que presentan las bacterias Gram-positivas en su membrana plasmática. La composición del medio de tratamiento y su pH también son factores que pueden afectar a la resistencia microbiana y la presencia de daño subletal tras tratamientos de PEAV. La resistencia de las células de E. coli y L. monocytogenes en fase exponencial de crecimiento frente a tratamientos de PEAV de baja intensidad fue mayor en medio de tratamiento de pH neutro que ácido. Por el contrario, cuando se aplicaron tratamientos de PEAV de alta intensidad, no se observó efecto de este parámetro. A su vez, la resistencia a los PEAV de las células de L. monocytogenes en fase estacionaria de crecimiento fue mayor en medio de tratamiento neutro que ácido. Además, tras los tratamientos de PEAV aplicados en medio de pH neutro, se observó daño subletal en la membrana plasmática de una cierta proporción de las células supervivientes de E. coli en fase exponencial y de L. monocytogenes en fase exponencial y estacionaria de crecimiento. Por otro lado, las células de E. coli en fase estacionaria de crecimiento mostraron una mayor resistencia a los PEAV en medios de pH ácido que neutro. Además, gran parte de las células supervivientes a los tratamientos de PEAV aplicados a pH ácido presentaban daños subletales en su membrana plasmática. Puesto que, en este caso, el efecto del pH en la resistencia microbiana difería de lo observado tras otros tratamientos de conservación como el calor o las APH, se realizó un estudio más profundo para analizar este fenómeno. Nuestros estudios indicaron que la resistencia de E. coli a los PEAV estaba relacionada con el pH y la presencia de ácidos orgánicos en el medio de tratamiento. Las células de E. coli en fase estacionaria de crecimiento mostraban una elevada resistencia a los tratamientos de PEAV aplicados en medios de pH cercano a 4,0 en presencia de ácidos orgánicos (tales como ácido cítrico, acético, láctico o málico). Además, este efecto protector dependía de la concentración de ácidos orgánicos presentes en el medio de tratamiento. Se observó una relación lineal entre el log10 de la concentración de ácidos orgánicos y el grado de inactivación. Los PEAV se habían propuesto como una alternativa a la conservación de los zumos de frutas por calor, sin embargo, debido al alto contenido de ácidos orgánicos en estos productos, la higienización de los mismos por PEAV podría requerir el diseño de procesos combinados efectivos. Es difícil determinar qué tipo de interacción entre las moléculas de ácido y las estructuras celulares podría ser capaz de proteger a E. coli de los PEAV. Puesto que esta protección sólo ocurre en las bacterias Gram-negativas, probablemente esté relacionada con la membrana externa, estructura que podría proteger a las células de la electropermeabilización. Además, nuestros resultados han demostrado que esta protección está relacionada con una mayor capacidad de reparación de los daños y una mayor resistencia intrínseca. Por lo tanto, en presencia de ácidos orgánicos y a pH cercano a 4,0, los mecanismos de reparación de E. coli serían más eficientes, o los daños ocasionados en sus envolturas celulares en estas circunstancias serían menos severos y más fácilmente reparables. Por otro lado, la presencia de ácidos orgánicos en el medio de tratamiento no ejerció ningún efecto protector sobre L. monocytogenes. Incluso, en el caso del ácido cítrico se observó un efecto antimicrobiano adicional a pH ácido. También se ha estudiado el efecto de la actividad de agua del medio de tratamiento en la resistencia microbiana a los PEAV. Se ha observado que una reducción hasta valores de 0,94 en la actividad de agua del medio de tratamiento causaba un incremento significativo en la supervivencia E. coli. Este aumento de resistencia se ha atribuido principalmente a un incremento de la resistencia intrínseca bacteriana más que a un incremento en la capacidad de reparación de daños. Los estudios existentes en la literatura acerca del mecanismo de inactivación de las levaduras por PEAV son menos numerosos que en el caso de las bacterias. Así, en esta Tesis Doctoral se han investigado multitud de aspectos relacionados con este tema, tales como la influencia de factores microbiológicos, ambientales y del procesado en la resistencia de las levaduras a los PEAV y la aparición de daño subletal, los mecanismos de reparación de las células dañadas y la permeabilización de las envolturas fúngicas tras tratamientos de PEAV. Esta investigación ha permitido demostrar por primera vez la existencia de daño subletal en la membrana plasmática de S. cerevisiae y D. bruxellensis tras tratamientos de PEAV. Los resultados obtenidos mostraron que la resistencia de las levaduras a los tratamientos de PEAV y la proporción de células subletalmente dañadas dependía del microorganismo, el campo eléctrico aplicado y el tiempo de tratamiento. Sin embargo, el pH del medio de tratamiento no afectaba en gran medida a la supervivencia de las levaduras. El estudio de la reparación de los daños subletales causados por el tratamiento de PEAV en la membrana citoplasmática de S. cerevisiae demostró que, en este caso, la capacidad de reparación celular dependía del pH del medio de tratamiento y del medio de reparación. A pesar de que la cantidad de células dañadas era similar tras los tratamientos de PEAV aplicados a pH 7,0 y 4,0, en el primer caso las células dañadas se reparaban con mayor facilidad. Además, bajo las condiciones estudiadas, la reparación se completó en medios de pH ácido pero no en medios de pH neutro. Así, debido a que las levaduras tratadas por PEAV no se sensibilizan a las condiciones ácidas, sino que, por el contrario, su reparación y por tanto su supervivencia se favorecen, sería necesario buscar otras estrategias de conservación que, en combinación con los PEAV, fueran capaces de evitar la reparación celular incrementando de esta manera el efecto letal. La evaluación de los requerimientos biosintéticos de S. cerevisiae para su reparación mostró que, mientras un pequeño porcentaje de las células dañadas por los tratamientos de PEAV aplicados a pH 7,0 eran capaces de repararse, aparentemente, sin requerimiento biosintético alguno, la mayoría de las células requerían energía para completar su reparación. Cuando los tratamientos de PEAV se llevaron a cabo en medio de pH 4,0, la totalidad de las células dañadas necesitaron energía para repararse, y además, la gran mayoría precisó también síntesis de proteínas. Estos resultados sugieren que, o bien se requieren proteínas para completar el proceso de reparación, o las proteínas de la membrana plasmática son la estructura afectada en las levaduras por los tratamientos de PEAV aplicados a pH ácido. Por lo tanto, el mecanismo de inactivación de las levaduras por PEAV podría diferir del de las bacterias, ya que se ha observado que la reparación de estas últimas requiere síntesis de energía y además, en el caso de los Gram-negativos, es necesaria la síntesis de lípidos para completar el proceso de reparación. Por otra parte, se realizaron estudios de permeabilización de las envolturas celulares de las levaduras tratadas por PEAV mediante tinción con yoduro de propidio. Estos trabajos demostraron que los PEAV causaban la formación de poros mayores de 660 daltons en las envolturas celulares de las levaduras, confirmando que el daño de estas estructuras celulares es un evento decisivo en la inactivación de las levaduras por PEAV. Sin embargo, al contrario de lo observado en las bacterias, en S. cerevisiae no se demostró la existencia de poros reversibles. Generalmente se acepta que las levaduras son menos resistentes a los PEAV que las bacterias. Sin embargo, un estudio comparativo realizado en esta Tesis Doctoral, ha demostrado que este hecho depende del pH del medio de tratamiento y del medio de recuperación utilizado. Si se observa la recuperación celular en medio no selectivo, la resistencia de S. cerevisiae a los tratamientos de PEAV aplicados a pH neutro fue similar a la de E. coli; mientras que cuando los tratamientos de PEAV se aplicaron a pH ácido, la resistencia de esta levadura fue similar a la de L. monocytogenes. Si se observa la recuperación celular en medio selectivo con cloruro sódico, se demuestra que la resistencia de los tres microorganismos estudiados fue similar. Por lo tanto, las principales diferencias observadas en la supervivencia microbiana se debieron fundamentalmente a la reparación de los daños subletales bajo determinadas circunstancias. Así, el estudio de la capacidad de reparación celular puede resultar de gran importancia desde el punto de vista práctico. Por otro lado, la recuperación de las células en medio selectivo puede indicar el nivel de inactivación que se obtendría al evitar la reparación de las células dañadas. En relación a las APH, en esta investigación se ha estudiado la influencia del pH y la composición del medio de tratamiento en la resistencia microbiana y la aparición de daño subletal. Los resultados obtenidos han confirmado que las APH causan daño subletal en la membrana plasmática de E. coli, L. monocytogenes y S. cerevisiae. La resistencia microbiana y la proporción de células dañadas tras los tratamientos de presurización dependieron del tipo de microorganismo, de la intensidad del tratamiento aplicado, y del pH y la composición del medio de tratamiento. Tras tratamientos aplicados a pH ácido ambas bacterias mostraron una menor resistencia y una mayor proporción de células dañadas que a pH neutro. Además, la sensibilidad bacteriana a la presurización fue mayor en tampón fosfato salino que en tampón McIlvaine citrato-fosfato. Sin embargo, el pH y la composición del medio de tratamiento no afectaron a la supervivencia de las levaduras tras tratamientos de APH. Por otra parte, en esta investigación también se ha estudiado el mecanismo de inactivación microbiana por ácido sórbico, tert-butil hidroquinona (TBHQ) y citral, con objeto de determinar las condiciones más apropiadas de utilización de estos agentes en procesos combinados. En relación al citral, se ha evaluado la inactivación, presencia de daño subletal, y los mecanismos de las células dañadas para repararse. Además, también se ha estudiado la influencia de diversos factores en la resistencia microbiana y aparición de daño subletal. Los estudios de inactivación microbiana en presencia de citral mostraron que la supervivencia celular dependía de la concentración microbiana inicial, el pH del medio de tratamiento, la concentración de citral y el tiempo de tratamiento. A concentraciones celulares por encima de 107 UFC/ml, cuanto mayor fue el número inicial de microorganismos, se observó menor inactivación. Además, al contrario del comportamiento general de los microorganismos en presencia de otros constituyentes de los aceites esenciales con capacidad antimicrobiana, en la mayoría de los casos, las células de E. coli, L. monocytogenes y S. cerevisiae mostraron una mayor resistencia al citral a pH ácido que neutro. La resistencia de E. coli y S. cerevisiae, fue mayor en medio de pH 4,0 que en medio de pH 7,0. En el caso de L. monocytogenes, la influencia de la temperatura durante el tratamiento de citral fue decisiva: a 20ºC su comportamiento fue similar al observado en E. coli y S. cerevisiae. Sin embargo, a temperaturas de refrigeración, L. monocytogenes mostró mayor resistencia al citral a pH neutro que ácido. Por otra parte, nuestros resultados han demostrado por primera vez que el citral es capaz de causar daño subletal en la membrana plasmática de E. coli, L. monocytogenes y S. cerevisiae a pH 7,0 y 4,0. Además, este agente también afectó la membrana externa de E. coli. Los estudios de permeabilización de las células de E. coli afectadas por citral demostraron que los daños ocasionados por este compuesto en las envolturas celulares eran un elemento clave en la inactivación microbiana por citral. El estudio de los requerimientos biosintéticos de las células de E. coli dañadas subletalmente por citral mostraron que la mayoría de las células requería energía y síntesis de lípidos para repararse, lo que confirmaría que las envolturas celulares son el principal lugar de acción del citral. Por otra parte, la eliminación de los factores de resistencia ¿S y ¿B reducía la resistencia de E. coli y L. monocytogenes respectivamente. Bajo las condiciones de tratamiento investigadas, la presencia de TBHQ causó daño subletal en la membrana citoplasmática de L. monocytogenes a pH ácido y neutro, pero no afectó a las células de E. coli. También se evaluó la inactivación y la presencia de daño subletal por la acción de ácido sórbico en S. cerevisiae y D. bruxellensis. La inactivación de S. cerevisiae y D. bruxellensis en presencia de ácido sórbico dependió del microorganismo, la concentración de ácido sórbico, el pH del medio y el tiempo de tratamiento. Tal y como indica la teoría clásica de acción de los ácidos orgánicos, nuestros resultados mostraron que el efecto antimicrobiano del ácido sórbico fue mayor cuanto menor fue el pH del medio de tratamiento. Además, este conservante ocasionó la aparición de daños subletales en la membrana plasmática de las levaduras, lo que confirma que es capaz de actuar a nivel de las envolturas celulares. El conocimiento más profundo de los mecanismos de inactivación de los PEAV, las APH y los agentes antimicrobianos estudiados podría presentar gran utilidad en el diseño de procesos combinados que resultaran ventajosos. Además la detección de daño subletal indicaría las circunstancias bajo las cuales, la combinación de diversas técnicas de conservación podría resultar ventajosa. Los PEAV se han propuesto como alternativa a la conservación por calor de productos ácidos como los zumos de frutas. Sin embargo, bajo estas condiciones las bacterias Gram-negativas muestran una elevada resistencia a los PEAV. Por lo tanto, se diseñó un proceso combinado que fuera capaz de incrementar el grado de inactivación de E. coli O157:H7 en zumo de manzana. Este proceso combinado incluía el almacenamiento en refrigeración del zumo tratado por PEAV con objeto de lograr la inactivación de las células subletalmente dañadas como consecuencia de las condiciones ácidas. En esta Tesis Doctoral se ha desarrollado un modelo matemático basado en la distribución Weibull capaz de predecir la supervivencia E. coli O157:H7 en zumo de manzana tratado por PEAV y sometido a un almacenamiento posterior en condiciones de refrigeración. Por otra parte, las levaduras dañadas por PEAV mostraban una elevada capacidad de reparación en condiciones ácidas, lo que podía complicar la conservación de productos ácidos utilizando esta tecnología. Así, para prevenir la reparación celular, se estudió el efecto de la aplicación combinada de PEAV y ácido sórbico. Los resultados obtenidos mostraron que la aplicación de un tratamiento de PEAV de baja intensidad en presencia de 2.000 ppm de ácido sórbico, seguido de un periodo de almacenamiento posterior, presentaba efecto letal sinérgico a pH 4,6 y 3,8, lográndose en este último caso la inactivación de más de 5 ciclos log10 de S. cerevisiae y D. bruxellensis. La combinación de PEAV y ácido sórbico también presentó ventajas en la inactivación de las células de E. coli dañadas que habían mostrado resistencia al almacenamiento en medio ácido en ausencia de ningún agente antimicrobiano. En nuestra opinión, el efecto sinérgico mostrado por la combinación de PEAV y ácido sórbico podría deberse a que este agente incrementa los daños ocasionados por los PEAV en las envolturas celulares causando finalmente la inactivación de los microorganismos, además de que las alteraciones ocasionadas en estas estructuras por los PEAV podrían facilitar el acceso del ácido sórbico al interior celular. Por otro lado, la combinación de PEAV y citral no incrementó la inactivación de E. coli, probablemente debido a que los PEAV no afectaban la membrana externa de esta bacteria, por lo que no facilitarían el acceso del citral a la membrana plasmática, que se considera el principal lugar de acción de los terpenos. La combinación de APH y 100 ppm de TBHQ seguida de un almacenamiento durante 24 horas a temperatura de refrigeración mostró efecto letal sinérgico, permitiendo la inactivación de más de 6 ciclos log10 de E. coli y L. monocytogenes a pH 7,0 y 4,0. Este efecto letal sinérgico podría deberse a que la acción de las APH podría facilitar la acción de la TBHQ en la membrana citoplasmática. Además, la combinación de APH con 1.000 ppm de citral incrementó el efecto letal observado, logrando en la mayoría de los casos, más de 5 ciclos log10 de inactivación en E. coli y L. monocytogenes. Las células dañadas subletalmente por el tratamiento de APH podrían inactivarse por la acción del citral. Por otra parte, en el caso de las bacterias Gram-negativas, la acción sinérgica de las APH y el citral podría relacionarse con los daños ocasionados por la presurización en la membrana externa, lo que facilitaría el acceso del citral a su estructura diana. Para confirmar esta hipótesis se estudio el efecto letal de la combinación de calor y citral sobre E. coli a pH 4,0 y 7,0. Los resultados obtenidos mostraron que esta combinación también presentaba un gran efecto sinérgico, probablemente debido a que el calor afectaba en gran medida a la membrana externa de las células. Así, se logró la inactivación de más de 4 y 5 ciclos log10 de células a pH 4,0 y 7,0 respectivamente. En este caso no fue necesario ningún periodo de almacenamiento posterior para que el citral actuara, lo que es muy positivo desde un punto de vista práctico. A modo de resumen, esta investigación indica que un análisis exhaustivo del mecanismo de inactivación microbiana por un determinado método de conservación, así como la evaluación de los factores que afectan la resistencia microbiana y la aparición de daño subletal, pueden resultar de gran ayuda en el diseño inteligente de los procesos de conservación de los alimentos. Además, la detección de daño subletal puede mostrar las condiciones bajo las cuales diversos métodos de conservación pueden actuar de manera sinérgica, permitiendo la obtención de productos microbiológicamente seguros y con una calidad organoléptica adecuada.