Evaluation of the factors that determine the effectiveness of non-thermal atmospheric plasma in the inactivation of foodborne pathogenic microorganismseffect of the treatment on cell membranes

Resum

Las actuales exigencias del consumidor hacia alimentos de elevada calidad nutritiva y sensorial, con características similares a las del producto fresco y libres de aditivos han llevado al desarrollo de nuevas tecnolog.as de procesado y conservación, como alternativa a otros métodos tradicionales más agresivos sobre sus propiedades organolépticas, nutritivas y funcionales, que han abierto nuevas expectativas para asegurar la calidad microbiológica de los alimentos. Recientemente, se ha conseguido la obtención, a temperatura ambiente y presión atmosférica, de plasmas de gases. Esta nueva técnica, el Plasma Atmosférico No térmico (PANT), por su capacidad para inactivar tanto células vegetativas como esporos bacterianos y fúngicos, abre un amplio abanico de posibilidades para su uso en la industria alimentaria para mejorar la calidad microbiológica de los alimentos o para la esterilización de material de envasado o diversas superficies de contacto. Además de su efectividad antimicrobiana, destaca el hecho de que presenta, en comparación con otras estrategias de conservación de alimentos, otras ventajas muy importantes, como son el bajo coste de aplicación, el empleo de tiempos cortos de tratamiento, la posibilidad de tratar una amplia variedad de alimentos, incluso previamente envasados, y el ser una técnica medioambientalmente sostenible, por lo que se considera como una tecnóloga sumamente prometedora para su aplicación en la industria alimentaria. Sin embargo, para el diseño de tratamientos eficaces que garanticen el grado de inactivación deseado, resulta necesario un conocimiento extenso de aquellos factores que determinan su efectividad antimicrobiana, as. como de los mecanismos responsables de la misma. El objetivo general de esta Tesis Doctoral fue evaluar la potencialidad del PANT como sistema alternativo de higienización de los alimentos, abordando su efectividad en la inactivación de algunos de los microorganismos patógenos de transmisión alimentaria más importantes (Salmonella entérica serovariedad Enteritidis, Salmonella enterica serovariedad Typhimurium, Listeria monocytogenes y Escherichia coli O157:H7), as. como las bases moleculares de su efecto letal. Se evaluó la influencia que las condiciones de generación del plasma, en relación a la composición (aire o nitrógeno) y velocidad de flujo (5, 10, 15 l/min) del gas precursor, ejercen sobre la efectividad antimicrobiana del PANT, comprobando que, en todos los casos, con los plasmas de aire se consegu.an mayores tasas de inactivación. Al determinar la resistencia al PANT que exhib.an los patógenos tras su crecimiento en presencia de diferentes ácidos hasta un valor de pH de 4,5 y en un amplio rango de temperaturas, entre 10 y 45.C, as. como tras su exposición, durante diferentes períodos de tiempo (5 y 120 min), a diversas condiciones subletales, como un tratamiento térmico moderado (45.C), o exposición a la acidez (pH 4,5) o frío (0.C), se observó. que .ésta apenas se veía afectada, lo que supone una ventaja adicional para esta tecnóloga a la hora de su implementación a nivel industrial. La aplicación de idénticos tratamientos por PANT sobre diferentes superficies puso de manifiesto que esta tecnóloga resulta más eficaz para la descontaminación de superficies abióticas que para la de alimentos, detectándose, asimismo, diferencias en el efecto letal conseguido entre los distintos alimentos estudiados (chorizo, salami, bacón, salmón ahumado, tofu y manzana), lo que indica que algunos factores asociados a su superficie, como rugosidad, adsorción de especies reactivas del plasma o humedad, podr.an afectar a la supervivencia microbiana. Sin embargo, para cada alimento evaluado, las tasas de inactivación conseguidas para los diferentes patógenos, tras un determinado tiempo de tratamiento, mostraron una escasa variabilidad. Finalmente, se evaluaron los cambios morfológicos y físico-químicos inducidos en los microorganismos tras su exposición al PANT. Concretamente, se determinaron los cambios en la composición química mediante espectroscopía de infrarrojos con transformada de Fourier (FTIR) y las modificaciones en la morfología y estructura celular por microscopía electrónica, evaluándose, asimismo, la integridad de la membrana citoplasmática aplicando técnicas de espectrofotometría UV y de citometría de flujo. El conjunto de información proporcionada sugiere que el mecanismo letal del PANT podría variar entre las especies bacterianas Gram positivas y Gram negativas. Los daños originados en las envolturas celulares ser.an la principal causa de la pérdida de viabilidad de las bacterias Gram negativas, lo que podría facilitar la acción de algunos agentes antimicrobianos que, en condiciones normales, resultan ineficaces frente a este grupo bacteriano por su incapacidad de atravesar su membrana externa, abriendo la posibilidad de dise.ar nuevos procesos combinados. Sin embargo, las lesiones infringidas en otras dianas celulares, como el ADN y/o sistemas enzimáticos, ser.an las que conducir.an a la muerte celular en las especies Gram positivas.